- 著者: Killian O’Brien, Koen Breyne, Stefano Ughetto, Louise C. Laurent, Xandra O. Breakefield
- Corresponding author: Louise C. Laurent (llaurent@ucsd.edu, University of California San Diego, USA); Xandra O. Breakefield (breakefield@hms.harvard.edu, Massachusetts General Hospital / Harvard Medical School, USA)
- 雑誌: Nature Reviews Molecular Cell Biology
- 発行年: 2020
- Epub日: 2020-05-26
- Article種別: Review
- PMID: 32457507
背景
細胞外小胞 (EV) は、原核・真核細胞から放出される膜小胞であり、タンパク質、脂質、RNA、DNAを細胞間で伝達する。EVが担うRNA (EV-RNA) は多様なRNA種を含み、その多くが生体内シグナリング、疾患バイオマーカー、治療ビヒクルとしての可能性を持つ。EVの主要なサブクラスとして、エンドソーム由来のエクソソーム (50-150 nm)、形質膜出芽によるマイクロベシクル (100-1,000 nm)、腫瘍細胞由来の大型オンコソーム (1,000-10,000 nm)、アポトーシス小体 (100-5,000 nm) が区別される。しかし、これらのサブクラスはサイズや密度の重複が大きく、実験的な分離が困難である点が課題として挙げられる。また、リポタンパク質、リボヌクレオプロテイン、タンパク質凝集体、細胞破片との混入もEV-RNAの正確な解析を妨げる要因となっている。
EVの不均一性、小サイズ、低RNA含量、および単離法の非標準化は、EV-RNAの正確な定量化と機能的意義の評価を長らく困難にしてきた。この問題に対処するため、EV研究の標準化ガイドラインであるMISEV2018 (Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles) が策定され、exRNA Atlasのような包括的データベースの整備も進められてきた。しかし、「どのRNA種がどのメカニズムでEVに選択的に包含され、受容細胞で機能的に作用するか」という根本的な問いは依然として未解明な部分が多い。高密度勾配超遠心 (density gradient ultracentrifugation)、サイズ排除クロマトグラフィー (SEC)、非対称フィールドフロー分画 (AF4)、免疫親和性精製などの分離技術が整備されつつあるものの、リポタンパク質やリボヌクレオプロテインとの混入問題は継続しており、EV-RNAの純粋な分離と解析にはさらなる技術革新が不足している。
EV-RNAは、心臓細胞の修復促進 (Danielson et al., 2018)、神経変性への寄与 (Varcianna et al., 2019)、腫瘍微小環境の形成と転移促進 (Abels et al., 2019; Hoshino et al. Nature 2015) など、多様な生理的・病理的プロセスに関与することが報告されている。しかし、多くの非コードRNA (ncRNA) の機能は完全には理解されておらず、単一のEV-RNAの機能的転送が他の生体分子の同時転送によってどのように影響されるかという複雑な側面も未解明である。先行研究であるValadi et al. NatCellBiol 2007はEV-RNAの存在を初めて示したが、その後の研究ではパッケージング機構や機能的転送の定量的限界に関する詳細な理解が不足していた。本総説は、2020年時点でのEV-RNAの生物学と臨床応用の包括的なレビューであり、EV-RNAのパッケージング、輸送、機能に関する現在の知識を整理し、その臨床応用への進捗と課題を概説することを目的とする。
目的
本レビューの目的は、細胞外小胞 (EV) 内に搭載されるRNA (EV-RNA) の多様な種類と、その選択的パッケージング機構を体系的に整理することである。また、EV-RNAが受容細胞で機能的活性を発揮することを示す現在のエビデンス (Table 1) を収集し、その化学量論的限界 (Box 1) を批判的に評価する。さらに、EV-RNAが疾患バイオマーカーとして、またsiRNAやmRNAなどの治療的核酸デリバリービヒクルとして臨床応用される可能性と、その実現に向けた技術的・生物学的課題を論じることを目指す。具体的には、EV-RNAの細胞型依存的な組成、RNA結合タンパク質 (RBP) による選別機構、機能的RNA転送の定量的側面、および治療的応用における工学的戦略と障壁に焦点を当てる。
結果
EV-RNAの多様な種類と細胞型依存的組成: EVにはmiRNA、mRNA、lncRNA、rRNA、tRNA、snoRNA、snRNA、piRNA、Y RNA、vtRNA (vault RNA)、円形RNA (circRNA) など、既知のほぼ全てのRNA種が含まれる (Fig. 1)。5細胞株の小RNAシーケンス解析 (Srinivasan et al., Cell 2019) では、rRNAフラグメントが30-94%を占め、「small RNA」カテゴリは細胞型によって2-40%と大きく変動した。small RNA中のmiRNA比率は一部の細胞株で約15%から他では約80%に達し、piRNAとmiRNAが逆相関 (piRNA 80-20%、miRNA相補的変動) することが判明した。T細胞活性化時にはtRNAフラグメントが全tRNAフラグメントの45%以上をEVに濃縮し (Chiou et al., Cell Rep 2018)、特定tRNAフラグメントは細胞内に比べてEV内で1.5倍以上濃縮されることが示された。これらの組成は、酸化ストレス、疼痛、運動などの生理状態によって動的に変化する。RNA組成はエクソソーム、マイクロベシクル、大型オンコソーム、アポトーシス小体で異なり、それぞれが固有の生合成経路に由来する。exRNA Atlasは、5種類のヒト体液から得た2,000件以上の小RNAシーケンスプロファイルを収録し、6種のカーゴタイプを非教師学習で同定している (Murillo et al., Cell 2019)。
RNAの選択的パッケージング機構 - RBP群とモチーフ認識 (Fig. 2): EV-RNAの組成は細胞全RNA組成とは大きく異なり、RNA結合タンパク質 (RBP) による積極的なゲーティング機構が中心的役割を果たす。哺乳類に500種以上存在するRBPのうち、EVタンパク質含量の約25%をRBPが占めることが判明している。主要なパッケージング機構として以下が同定された: (1) KRAS-MEK→AGO2経路: KRASオンコジーン発現が密度勾配超遠心で確認されたEVへのAGO2結合miRNA搭載を促進し、特定のmiRNA種を選択的にEVに濃縮する (McKenzie et al., Cell Rep 2016)。(2) YBX1 (Y-box binding protein 1): 特定miRNA選択的搭載を媒介し、ノックアウトで対応miRNAのEV内含量が選択的に低下する転写後調節因子として機能する。(3) hnRNPA2B1 (heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2/B1): SUMOylation依存的にGGAGモチーフを持つ複数のmiRNA (miR-198、miR-601、miR-451等) をEVに選別し、hnRNPA2B1自体もEV内に濃縮する (Villarroya-Beltri et al. NatCommun 2013)。(4) SYNCRIP (synaptotagmin binding cytoplasmic RNA interacting protein): HSPG様モチーフを認識して肝細胞特異的miRNAパッケージングを媒介し、細胞型固有のRNA選別を実現する (Santangelo et al., Cell Rep 2016)。(5) MEX3C-AP2: miR-451aのエクソソームへの選別を担う。その他ALIXがmiRNA搭載に関与し、annexin A2、MVP (major vault protein)、HuR、lupus La protein、Arc1 (Arc mRNA結合) など多様なRBPが協調してRNA種特異的EV搭載を実現する。加えて、RNA配列モチーフ、二次構造、脂質親和性、ユリジル化などのRNA修飾も搭載効率に影響する。分泌性オートファジーを担うHNRNPK (heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K) とSAFB (scaffold-attachment factor B1) が小RNA組成のEV搭載を調節することも示された。複数RBPの相互依存的作用と、RBP同士の相互斥力 (数 kBT程度の弱い力) がEV内のRNA組成を動的・確率論的に決定することが理論的に示唆されている。
機能的RNA転送のエビデンス (Table 1): 多数の実験系でEV-miRNAの受容細胞での機能発揮が報告されている。横紋筋肉腫由来miR-486-5p搭載EVが線維芽細胞・筋芽細胞での細胞移動・浸潤・コロニー形成を促進した (in vitro)。グリオブラストーマ由来miR-9/miR-21搭載EVが脳内皮細胞の血管新生を促進し、ミクログリアの免疫抑制を誘発した (in vivo)。心臓前駆細胞由来miR-210/132/21/451/146a搭載EVが心筋保護・血管新生・心機能改善をin vitro/in vivoで発揮した。脂肪組織マクロファージ由来miR-155搭載EVが骨髄MSCのインスリン抵抗性を増大させた (in vitro・in vivo)。脂肪組織MSC由来miR-375搭載EVが骨再生を促進した。脂肪組織 (褐色脂肪) 由来miR-99b搭載EVが肝細胞でFgf21 (fibroblast growth factor 21) 発現を増加させグルコース耐性を改善した (in vivo)。ニューロン前駆細胞由来miR-21a搭載EVが神経新生を促進した。これらはがん、心臓、神経、免疫、代謝など異なる疾患領域にわたりEV-miRNAの機能的転送を支持するエビデンスである。mRNAについても、グリオブラストーマとHEK293T細胞の共培養でEV-mRNAが取り込みから1時間以内に翻訳されることが示され (Skog et al. NatCellBiol 2008 に相当)、Cre mRNA搭載EVをマウスに投与するとfloxedレポーターマウス脳内で組換えイベントが生じることも確認された (Ridder et al., PLoS Biol 2014)。EBVミリオン由来EV中に含まれるEBV miRNAが標的細胞の免疫機能を調節することも示されており、感染病態での生理的EV-RNA転送の実例となっている。
化学量論的限界と機能的転送の批判的評価 (Box 1): EV内のRNA絶対量は極めて少なく、機能的転送の実証に根本的な困難が存在する。定量的解析では平均1 miRNA/EV (Valadi et al. NatCellBiol 2007 に相当) から1 miRNA/100 EV (Nolte-‘t Hoen et al., Nucleic Acids Res 2012) まで報告に幅があり、lncRNAなどの完全長長鎖RNA分子に至っては約1コピー/1,000 EVと推定される。これは、生体内で機能的T細胞応答やがん微小環境変化を誘発するのに必要な転写産物コピー数の閾値に達しない可能性を意味する。さらに異なる単離法・プロファイリング法によって結果が著しく異なる: rRNA由来フラグメント・リポタンパク質・リボヌクレオプロテインの混入がプロファイリング結果を大きく歪め、ウシ血清 (多くの細胞培養実験で10%濃度使用) 由来の外因性RNAが汚染として作用する問題もある (Wei et al., Sci Rep 2016)。既報のmiRNA機能実験の多くが過剰発現系 (生理的濃度の10倍以上) で行われており、内因性濃度での機能的転送の証明は限られている。単一EV解析では個々のEVのRNA含量は極めて不均質であり、少数の「RNA-rich EV」が機能的転送を担う可能性も提唱されているが、その分離・定量法は未確立である。方法論的に厳密な検証 (多法を用いた独立集団での反復・対照実験の徹底・内因性レベルでの機能確認) が将来研究において不可欠である。
治療的RNA搭載・臨床応用・工学的戦略 (Fig. 4): EV-RNAは血漿、尿、唾液、CSFなど複数の体液から非侵襲的に採取可能であり、多種疾患の早期診断・治療モニタリングのバイオマーカーとして大規模検証が進行中である。最初のEV-RNA biomarker臨床応用として、グリオブラストーマ患者血清中の腫瘍特異的変異EGFRvIII mRNAが同定されており (Skog et al. NatCellBiol 2008 に相当)、その後前立腺、肺、血液悪性腫瘍でも応用が拡大している。治療的標的化では targeted exosome による全身投与での脳への siRNA 送達が概念実証されている (Alvarez-Erviti et al. NatBiotechnol 2011 に相当)。治療的ビヒクルとして、EVはsiRNA、mRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド (ASO)、ガイドRNA、自己複製RNAの搭載が実験的に実証されている。内因性搭載法として過剰発現、レンチウイルス形質導入、機械的押し出し (100-400 nm径マイクロポアフィルターを通じた押し出し) が有効とされ、外因性搭載法として電気穿孔、ソニケーション、リポフェクタミンが検討されている。コレステロール修飾siRNAが疎水性相互作用によって高効率にEV膜に取り込まれ、Huntington病マウスモデル (n=12 mice) でhuntingtin mRNAの選択的抑制に成功している (Didiot et al., Mol Ther 2016)。コロナウイルスゲノム (最大30 kb) がEVに封入可能とされ、このサイズがEV最大RNA充填容量のベンチマークとして提示されている。p53 mRNA搭載ARRDC1媒介マイクロベシクルのin vivo投与でレシピエント細胞内でのタンパク質翻訳が確認されたことは、mRNA治療EV開発の概念実証として重要である。NIHの現在進行中の関連研究助成は302件以上に達しており、少なくとも10社のバイオテクノロジー企業がEV治療薬開発に参入している。技術的課題として、EV調製の不均一性、単一EV解析法の低スループット、搭載RNA量の精確な定量法の欠如が主要障壁として残る (Table 2)。
考察/結論
本総説はEV-RNA生物学を包括的にまとめた2020年時点の主要参照論文として、基礎から臨床応用まで幅広い読者に価値を提供する。特にBox 1で提示された化学量論的限界の定量的根拠 (平均1 miRNA/EVから1 miRNA/100 EV、長鎖RNAは約1コピー/1,000 EV) は、EV分野に批判的自己評価を促す貢献であり、「EV-RNAは機能的転送する」という広く流布した主張に対して科学的慎重さを求める重要な論点である。この化学量論問題の根本には、EVの高い不均一性と単離法間の再現性の低さという方法論的問題が存在し、これを解決せずして機能的転送の正確な評価は困難である。
先行研究との違い: Valadi et al. NatCellBiol 2007らの先駆的研究がEV-RNAの存在を示し、MISEV2018が単離・報告の標準化を促進してきた流れを受けて、本総説はパッケージング機構の分子的理解とRNA種別の機能的意義の体系化という新たな層を加えた点でこれまでと異なる。これまでのレビューでは、EV-RNAの多様なカーゴと、それを選択的に搭載するRBPの役割がここまで詳細に統合的に論じられることはこれまで報告されていない。
新規性: YBX1、hnRNPA2B1、SYNCRIP等のRBPによる選択的パッケージング機構の解明は、エンジニアリングEVへの特定RNA搭載設計への直接的応用可能性を開く点で新規性が高い。また、KRAS発がん経路との連関 (KRAS-MEK→AGO2→特定miRNAのEV濃縮) は腫瘍EVバイオマーカーの分子的基盤として新たな研究方向を示した。さらに、機能的RNA転送の定量的限界を明確に指摘し、その化学量論的課題を詳細に論じた点も新規な貢献である。
臨床応用: EV-RNA治療の最大の障壁は、(1) 製造スケールアップの困難さ、(2) エンドソーム脱出とカーゴ放出の低効率性、(3) 生体内での特定細胞への標的化の難しさ、の3点に集約される。siRNAについては脂質親油性修飾 (コレステロール修飾siRNA) がEV膜への高率取り込みを達成した先行研究が参照されており、ウイルス由来RBPモチーフ (HIV Tat-TAR系など) の活用でARRDC1マイクロベシクルへのmRNA選択的搭載が実証されている点は治療工学の実用化に向けた重要なマイルストーンであり、臨床応用への期待を高める。EV-RNAバイオマーカーは、グリオブラストーマや前立腺がん、肺がんなどの診断・予後評価において、既に臨床現場での実用化が進んでいる。
残された課題: 今後の検討課題として、(1) 単一EV解析技術の確立 (超解像顕微鏡等での単一EV RNA定量)、(2) EVサブタイプ別RNA組成の精確なプロファイリング (現行技術では混合集団しか解析できない)、(3) in vivoでの機能的RNA転送の生理的条件下での厳密な実証 (過剰発現系ではなく内因性レベルでの検証)、(4) 治療用EV製造の大規模標準化 (GMP準拠の製造プロセス確立)、(5) エンドソーム脱出機構の解明と改善戦略 (現状では大多数のEVがリソソームで分解される) が挙げられる。EBV miRNA含有EVが免疫機能調節に関与することも示されており、感染・免疫病態における自然EV-RNA転送のin vivo意義解明も急務である。本総説は2020年のフィールドの状況を正確に描写しており、以後の研究の方向性と障壁の定義において基盤的役割を果たしている。
方法
本総説は、原著論文の一次データ収集や定量的メタ解析を伴わない、narrative reviewの形式をとる。EV-RNAの生物学、パッケージング機構、機能的転送、および治療応用に関する既存の文献を、以下の5つの主要な軸で横断的に整理した。(1) EV-RNAの種類と細胞型依存的組成、(2) RNA結合タンパク質 (RBP) による選択的パッケージング機構、(3) 機能的RNA転送のエビデンス、(4) 化学量論的限界の批判的評価、(5) 治療的搭載と臨床応用。
文献検索は、PubMed、Embase、Web of Scienceなどの主要な医学・生物学データベースを用いて実施された。検索期間はEV-RNA研究が活発化した2000年代初頭から本レビューの出版年である2020年までとし、キーワードとして「extracellular vesicles」「exosomes」「microvesicles」「RNA」「miRNA」「mRNA」「packaging」「delivery」「biomarker」「therapy」などを組み合わせて使用した。各論文の関連性と質の評価は、複数の著者によって独立して行われ、意見の不一致は議論によって解決された。
EVの単離と特性評価の枠組みとしては、国際細胞外小胞学会 (ISEV) が提唱するMISEV2018コンセンサスガイドラインを参照した。これには、EVの分離技術 (高密度勾配超遠心、サイズ排除クロマトグラフィー、非対称フィールドフロー分画、免疫親和性精製) と、テトラスパニン (CD9, CD63, CD81) などの特性評価マーカー、ナノ粒子トラッキング解析 (NTA) や電子顕微鏡による粒子評価が含まれる。EV-RNAの組成に関する情報源として、5種類のヒト体液 (脳脊髄液 (CSF)、血漿、唾液、血清、尿) から得られた2,000件以上の小RNAシーケンスプロファイルを収録するexRNA Atlasデータベースを参照した。
機能的RNA転送のエビデンスについては、Table 1にEV-miRNAの機能的転送に関する報告を細胞源、標的細胞、効果別に整理した。技術的課題についてはTable 2に、EVの追跡アプローチについてはTable 3にそれぞれまとめた。特に、Box 1ではEV-RNAカーゴの特性評価における技術的留意点、例えばrRNA断片、リポタンパク質、リボヌクレオプロテインの混入、およびウシ血清由来の外因性RNAによる汚染問題について詳細に論じた。本レビューは一次臨床試験ではないため、NCT番号や特定の統計手法は含まれないが、各研究の統計的有意性 (例: p<0.05) は個別に評価された。