- 著者: Luo W, Zhang H-F, Li W, Xu C, Zhu H, Pereira M, Lyberger J, Eguchi S, Liao Y, Rosenblum JM, Marcondes M, Behbehani G, Sorensen PH, Lee D, Cairo MS
- Corresponding author: Cairo MS / Luo W (New York Medical College)
- 雑誌: Journal for ImmunoTherapy of Cancer
- 発行年: 2026
- Epub日: 2026-06-24
- Article種別: Original Article
- DOI: 10.1136/jitc-2025-014633
背景
ユーイング肉腫 (ES; Ewing Sarcoma) は EWS-ETS (Ewing Sarcoma RNA-binding Protein 1 / E26 Transformation-specific) 融合タンパクを特徴とする骨・軟部腫瘍であり、最多融合型 EWS-FLI1 (EWS/Friend Leukemia Integration 1 fusion oncoprotein) が代表的なドライバーである。転移/再発/難治性 (M/R/R; Metastatic/Relapsed/Refractory) 例の 5 年全生存率は 25% 未満、無増悪生存期間の中央値はわずか 9.1 ヶ月と予後不良である (Ladenstein 2010, Ribelles 2025)。ES は低腫瘍変異量で新抗原が少なく免疫チェックポイント阻害薬や T 細胞療法への奏効が期待しにくく (Grobner 2018)、自然免疫細胞である NK (Natural Killer) 細胞を主体とした免疫療法戦略が強く求められてきた。
NK 細胞は MHC クラス I (HLA クラス I; Human Leukocyte Antigen class I) 非依存的に腫瘍細胞を傷害でき、ES では MICA/B (MHC Class I Chain-Related Proteins A and B) 等の活性化リガンドが高発現し HLA クラス I が低発現するため NK 感受性が高い。Cho et al. (2010) および Tong et al. (2017) は ES における NK 細胞感受性の高さを示し、患者腫瘍内の活性 NK 細胞量増加が全生存改善と相関することを Stahl et al. (2019) が報告している。しかし ES 腫瘍微小環境 (TME; Tumor Microenvironment) では TGFβ (Transforming Growth Factor β) を主とする免疫抑制、腫瘍特異的標的化の欠如、乏しい腫瘍浸潤・持続性が NK 細胞療法の主要な耐性機序として知られており (Nayyar et al. 2019)、これら複数の機序を同時に克服する戦略はいまだ未解明であった。
IL1RAP (Interleukin-1 Receptor Accessory Protein) は IL-1 受容体補助タンパクで、ES では EWS-FLI1 を介して直接発現亢進し、システイン・グルタチオンプールの維持とアノイキス (anoikis) 耐性を通じて転移を促進する重要なドライバーであり、正常組織への発現は限定的である (Zhang 2021)。先行研究では IL1RAP 標的 ADC (Antibody-Drug Conjugate) が ES 前臨床モデルで有望な活性を示しているが (Zhang 2026)、IL1RAP-CAR (IL1RAP-targeted Chimeric Antigen Receptor)-NK 細胞療法は固形腫瘍では報告されていなかった。
また TGFβ1 存在下で NK 細胞を拡張して「刷り込む」手法 (TGFβ1 imprinting) が SMAD3 (Mothers Against Decapentaplegic Homolog 3) 抑制を介した TGFβ 耐性・炎症性サイトカイン亢進・細胞傷害性増強をもたらすことを Foltz et al. (2018) が示し、GD2 (ganglioside GD2) 標的 IgG1 抗体ジヌツキシマブが ADCC (Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity) を増強することは Yu et al. (2010) の先行研究で示されている。さらにポリマー結合型 IL-15 アゴニスト NKTR-255 が NK 細胞の持続性・増殖・活性を強化することを Miyazaki et al. (2021) が報告した先行研究があった。しかし TGFβ1 刷り込み・IL1RAP-CAR 工学・IL-15 アゴニスト・抗 GD2 抗体を統合した多機構同時攻略型 NK 細胞療法は ES において未確立であり、これらを組み合わせることで複数の TME 耐性機序を同時克服できるかどうかは不足していた知見であった。
目的
M/R/R ES に対して、TGFβ1 刷り込み IL1RAP-CAR-NK 細胞 (CAR-imNK) と IL-15 アゴニスト NKTR-255 および抗 GD2 抗体ジヌツキシマブを組み合わせた多剤免疫療法の in vitro 細胞傷害性・in vivo 抗腫瘍効果・生存改善を評価し、奏効および耐性の分子機序を明らかにする。
結果
IL1RAP-CAR-NK 細胞の IL1RAP 特異的細胞傷害性と in vivo 抗腫瘍効果：
IL1RAP-CAR mRNA を exNK (ex vivo-expanded NK; ex vivo 拡張 NK) 細胞に電気穿孔したところ (n=3 ドナー)、>60% の NK 細胞で CAR 発現が確認され、少なくとも 6 日間持続した (Fig 1B)。IL1RAP 高発現 ES 細胞株 A673・SKNMC に対する in vitro 細胞傷害性試験 (E:T; Effector-to-Target 比 0.05:1 〜 1:1、4 時間 BLI (Bioluminescence-based) アッセイ、n=3 独立反復) では、CAR-NK 細胞は Mock (非修飾 exNK) 細胞と比較して有意に高い細胞傷害性を示した (p<0.05 および p<0.01) (Fig 1D)。一方、IL1RAP 発現量が中程度 (EWS502、TC71) または低い (TC32) ES 細胞株への効果は軽度または無効であり、CRISPR/Cas9 で IL1RAP をノックアウト (KO1/KO2) した A673 細胞に対しても CAR-NK の優位性は消失した (Fig 1F)。さらに CAR-NK は Mock と比較して IFN-γ (Interferon-gamma) (p<0.05 および p<0.01) およびパーフォリン分泌を有意に増加させた (Fig 1G,H)。
同所性 NSG (NOD scid gamma) マウス異種移植モデル (A673-luc 脛骨内注入、n=9 例/群) では、週 1 回×6 週間の尾静脈投与において、CAR-NK 群は PBS (Phosphate-Buffered Saline) 対照群と比較して腫瘍成長を有意に抑制し (p<0.05) (Fig 1J,K)、肺転移率は PBS 群 65% に対して CAR-NK 群 30% (p<0.01)、Mock-NK 群 45% に対して 30% (p<0.05) と有意に低下した (Fig 1L)。
TGFβ1 高発現と TGFβ1 刷り込み CAR-NK 細胞の in vitro/in vivo 優位性：
R2 ゲノム解析プラットフォームを用いた遺伝子発現データ解析において、ES 患者腫瘍 (n=44) での TGFB1 log2 発現値は 7〜10 であるのに対し、正常骨格筋 (n=18) では 0.7〜1.7 にとどまり (Fig 2A)、ES 異種移植腫瘍は隣接筋肉に比べ TGFβ1 タンパクを有意に高く分泌していた (p<0.01) (Fig 2B)。これらの知見は TGFβ1 が ES TME において免疫細胞から産生されることを示唆する。
TGFβ1 刷り込み CAR-NK (CAR-imNK) と非刷り込み CAR-NK の短時間 in vitro 細胞傷害性比較 (n=3 生物学的反復) では、CAR-imNK が A673・SKNMC 双方に対して有意に高い傷害能を示した (p<0.05 および p<0.01) (Fig 2C)。IFN-γ 分泌も CAR-NK より有意に高かった (p<0.05 および p<0.01) (Fig 2D)。連続殺傷試験 (24 時間ごとに新鮮ターゲット細胞で再刺激、n=3 反復) では、CAR-NK は 4 回目の再刺激後に有意な傷害能低下を示した (p<0.05、0.01、0.001) のに対し、CAR-imNK は 6 回目まで持続的細胞傷害性を維持した (Fig 2E)。
in vivo では、FFluc 標識 imNK が FFluc-NK と比較して皮下 A673 腫瘍部位への有意に高い遊走を示し (p<0.01) (Fig 3B,C)、同所性モデル (A673-luc、n=9/群) において CAR-imNK は腫瘍成長を PBS 比有意に抑制 (p<0.001)・CAR-NK 比でも優位 (p<0.01 vs PBS) であり (Fig 3E)、生存率も PBS (p<0.001) および CAR-NK (p<0.01) に対して有意に改善した (Fig 3F)。腫瘍内 NK 細胞割合の定量解析でも CAR-imNK 群は CAR-NK 群より有意に高かった (p<0.05) (Fig 3G)。
NKTR-255 と ジヌツキシマブの追加による三剤併用の優越性：
GD2 ganglioside の発現は ES 細胞株間で異なり、A673 は高発現・SKNMC は低発現を示した (Fig 4A)。ジヌツキシマブ (IgG1 抗 GD2 抗体) は A673 に対して NK 細胞の ADCC を有意に増強したが (p<0.05 at 1、2、5、10 µg/mL)、GD2 低発現の SKNMC では効果がなかった (Fig 4B)。NKTR-255 (ポリマー結合型 IL-15 アゴニスト、40 ng/mL、72 時間前処理) は CAR-imNK の in vivo 残存性を有意に改善し (0.3 mg/kg 投与マウスの末梢血 NK% が有意上昇、p<0.0001) (Fig 4C)、in vitro 細胞傷害性試験では CAR-imNK+NKTR-255+ジヌツキシマブ三剤の細胞傷害性が他のあらゆる単剤・二剤組合せより有意に優れた (p<0.05 および p<0.01) (Fig 4D)。
同所性マウスモデルを用いた in vivo 7 群比較 (PBS+IgG / NKTR-255 / ジヌツキシマブ / CAR-imNK+IgG / CAR-imNK+NKTR-255 / CAR-imNK+ジヌツキシマブ / 三剤、各 n=9) では、NKTR-255 またはジヌツキシマブ単独は腫瘍成長抑制効果が乏しく、CAR-imNK との二剤はある程度の早期効果を示したが単剤との有意差には至らなかった。これに対して三剤 (CAR-imNK+NKTR-255+ジヌツキシマブ) は一次腫瘍成長を対照比 p<0.01・NKTR-255 比 p<0.01・CAR-imNK または ジヌツキシマブ単剤比 p<0.05・二剤組合せ比 p<0.05 で有意に抑制した (Fig 5B,C)。肺転移率は三剤群で 0%、対照群・全単剤群・二剤群との比較でいずれも p<0.0001 〜 p<0.001 と最優秀であった (Fig 5D)。生存率は三剤群が試験終点において 65% と最高値を示し、対照 / NKTR-255 比 p<0.001、CAR-imNK またはジヌツキシマブまたは CAR-imNK+ジヌツキシマブ比 p<0.01、CAR-imNK+NKTR-255 比 p<0.05 で有意に延長した (Fig 5E)。
scRNA-seq および mass cytometry による奏効・耐性機序の同定：
対照群と三剤群から採取した腫瘍組織の単細胞解析 (scRNA-seq + mass cytometry) を並行実施した (n=5/群)。ヒト細胞 (15,151 細胞) は 14 クラスターに分類されすべて ES 細胞と同定され、NK 細胞は腫瘍内の占有率が~0.1% と低く検出されなかった。ヒトクラスター 1 の DEG (Differentially Expressed Genes) の GO (Gene Ontology) 解析では TGFβ 応答・Wnt シグナル・アポトーシスが上位に濃縮された。Mass cytometry では三剤群で cPARP (Cleaved Poly-ADP-Ribose Polymerase) 陽性 ES 細胞の割合が有意に増加しており (p<0.05) (Fig 6C)、アポトーシス誘導を in situ で検証した。
一方、クラスター 13 では抗原提示処理・T 細胞傷害性関連プロセスが上位に濃縮され、その DEG として HLA-A、HLA-B、HLA-C (NK 抑制性受容体である KIR および NKG2A のリガンドをコードする) の発現が三剤群で有意に増加していた (Fig 6D)。in vitro 検証では CAR-imNK 単独または三剤添加により A673 細胞上の HLA-ABC (Human Leukocyte Antigen class A, B, C; NK 細胞の KIR (Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor) および NKG2A (Natural Killer Group 2A receptor) 抑制性受容体のリガンド) 発現が著明に亢進し、この増加は主に CAR-imNK 細胞が誘導する IFN-γ を介すると示唆された (Fig 6E)。マウス細胞 4 クラスター (DC (Dendritic Cell; 樹状細胞)・線維芽細胞・マクロファージ 2 種) の解析では、三剤群でマクロファージの DEG において走化・遊走関連プロセス (S100a9、Ccl2、Cxcl2 等) が圧倒的に濃縮されており (Fig 7C)、mass cytometry では M2 型マクロファージ (mCD206+) が三剤群で有意に減少していた (p<0.05) (Fig 7D)。さらにクラスター 6・7 では低酸素応答 (PDK1、ANGPTL4、FOXO3 等) が濃縮され、活性酸素種 (ROS; Reactive Oxygen Species) 代謝の変化を介した別の耐性機序が示唆された。
考察/結論
本研究は IL1RAP を標的とした CAR-NK 細胞療法を固形腫瘍に適用した初の前臨床報告であり、これまで報告されていない TGFβ1 刷り込み・IL1RAP-CAR・IL-15 アゴニスト・抗 GD2 抗体を統合した多機構同時攻略型免疫療法の有効性を初めて示した。
① 既存報告との違い: 先行研究では MCAM-CAR-NK+NKTR-255 や N-803+ジヌツキシマブの組合せが ES 異種移植モデルで一定の効果を示しているが (Luo 2024; Chu 2021)、これらと異なり、本研究は TGFβ1 刷り込みという後成的改変を IL1RAP-CAR 工学と組み合わせることで NK 細胞のシリアルキリング能・腫瘍ホーミング・生存性を同時に増強した点が独自である。NK 抑制受容体チェックポイントを解除する抗 NKG2A 抗体戦略 (Andre et al. Cell 2018) と異なり、TGFβ1 刷り込みはエピジェネティックな再プログラミングを通じて ES 特異的な環境適応を実現しており、TME への応用可能性が広い。また、TGFβ 経路の薬理学的遮断 (LY2157299 等) や dominant-negative TGFβRII の遺伝子導入と対照的に、刷り込み法は大型遺伝子構築物を必要とせず臨床移行が容易である。
② 新規性: IL1RAP は ES において EWS-FLI1 直接制御下の転移促進因子として同定されており (Bagati et al. CancerCell 2021 がTGFβ経路による免疫回避を示すように、TME の免疫抑制は多様な分子経路で冗長に構成されている)、その CAR 標的化は「IL1RAP を発現抑制すること自体が転移能を低下させる」特性を利用した二重作用戦略として新規である。scRNA-seq と mass cytometry を並行した単細胞レベルの耐性機序解析から、HLA-ABC の治療誘導性発現亢進が NK 抑制受容体 (KIR/NKG2A) を介した新規耐性経路であることを初めて ES において記述した。また、CAR 工学・TGFβ 刷り込み・IL-15 アゴニスト・ADCC 抗体という 4 軸の NK 最適化を統合した三剤レジメン (Yue et al. Cell 2026 が示す様に CAR 工学で多様な自然免疫細胞を最適化する潮流と一致) は本研究が初めてである。
③ 臨床応用: TGFβ1 刷り込み NK 細胞はすでに ES を対象とした臨床試験 TINKS で評価されており (Setty 2025)、NKTR-255 も NCT05664217・NCT06061809 で臨床開発中であるため、三剤の臨床移行障壁は低い。ジヌツキシマブは高リスク神経芽腫の標準治療に承認済みであり、GD2 高発現 ES への臨床応用は組合せプロトコルを洗練することで現実的な射程に入る。ただし、現行プロトコルでは IL1RAP と GD2 を共に高発現する ES 細胞株は A673 のみであり、GD2 発現を EZH2 阻害薬で誘導するアプローチや MCAM・B7-H3 標的 ADCC 抗体への代替も検討すべきである。
④ 残された課題: scRNA-seq では三剤治療にも関わらず腫瘍内 NK 細胞は~0.1% にとどまり、腫瘍ホーミングの絶対数増加が限定的であった。CXCR2 発現 NK 細胞を用いた腫瘍誘引強化戦略が現在検討中であり、今後の検討が必要である。HLA-ABC の治療誘導性発現亢進は NK 耐性の新規機序であり、CD28H・2B4 シグナルドメインを搭載したより強力な CAR 設計や HLA-E を標的とする NKG2A チェックポイント遮断との組合せが今後の研究課題である。また、NK 細胞を活性化する全身性 IL-15 シグナルは宿主 CD8 T 細胞による養子移入細胞の拒絶を誘引するリスクがあり、膜結合型 IL-15 の安全性を担保しながら治療効果を維持するアプローチの確立も残された課題として位置づけられる。
本研究は、遺伝的 (CAR)・後成的 (TGFβ1 刷り込み) に改変した IL1RAP-CAR-imNK 細胞と NKTR-255 および ジヌツキシマブの三剤併用が M/R/R ES の前臨床モデルで強力かつ多面的な抗腫瘍効果を発揮することを実証した。本アプローチは IL1RAP 高発現悪性腫瘍全般に拡張しうる革新的な免疫療法戦略である。
方法
NSG マウス脛骨内注入による ES 同所性異種移植モデルを用い、A673-luc 細胞 (2×10⁵/部位) を移植後に IVIS (In Vivo Imaging System) で腫瘍生着を確認した。NK 細胞は末梢血 PBMC を IL-21・4-1BBL 共発現フィーダー細胞 (K562-mbIL21-4-1BBL) で拡張 (exNK) し、TGFβ1 存在下拡張で imNK を作製した。IL1RAP-CAR mRNA (7D12 バインダー・CD28TM・4-1BB・CD3ζ の第 2 世代 CAR 構造、pcDNA3.1 ベクター) を電気穿孔 (5×10⁶ 細胞に 10 µg mRNA) で導入した。in vitro 細胞傷害性は BLI ベース 4 時間アッセイ (ルシフェラーゼ発現 ES 細胞 5×10⁴)、E:T 比 0.05:1〜1:1 で実施した。
in vivo 投与: PBS または NK/imNK または CAR-NK/CAR-imNK を 0.5〜1×10⁷ 細胞/個体/週 (尾静脈、週 1 回×6 週)。三剤群では NKTR-255 0.3 mg/kg (静脈内、2 週毎) + ジヌツキシマブ 15 µg/個体 (腹腔内、週 2 回×6 週) を追加。腫瘍は IVIS 週次観察、腫瘍長径 1.5 cm 到達時に死亡または安楽死とした。
機序解析: 三剤群 vs 対照群 (n=5/群) の腫瘍を採取し、gentleMACS で解離した単細胞懸濁液を scRNA-seq (ヒト細胞 14 クラスター・マウス細胞 4 クラスター) および mass cytometry で並行解析した。DEG の GO 解析で濃縮細胞プロセスを特定。データセット GEO GSE310801 で公開。統計: Student t 検定 (対応あり両側)、ANOVA (反復測定)、Fisher 正確確率検定、log-rank 検定。ランダム化・盲検化は実施せず (腫瘍生着量のばらつきによる観察バイアスを理由に)。