- 著者: Hyo-eun C. Bhang, David A. Ruddy, Viveksagar Krishnamurthy Radhakrishna, Justina X. Caushi, et al.
- Corresponding author: Frank Stegmeier (Novartis Institutes for Biomedical Research, Cambridge, MA); Joshua M. Korn (同)
- 雑誌: Nature Medicine
- 発行年: 2015
- Epub日: 2015-04-13
- Article種別: Original Article (Basic science / Methods)
- PMID: 25849130
背景
分子標的治療に対する耐性が「治療中に新たに獲得 (de novo)」されるのか「治療前から rare subclone として既に存在 (pre-existing)」しているのかは、長らく未解明な根本問題であった。pre-existing 耐性 hypothesis が正しければ「post-progression biopsyに基づく順次耐性治療」よりも「初回からの非交差耐性 combination therapy」が curative intent で優位となり、臨床戦略の根本転換を要する (Turke et al. CancerCell 2010 は NSCLC 細胞株 HCC827 で MET 増幅の rare 細胞が既に存在することを FISH で示し、本仮説を支持した先行研究)。しかし従来手法には限界が残されていた：(i) next-generation sequencing (NGS) の感度は ~0.1% allele frequency に頭打ちで、診断時の腫瘍 ~10⁹ 細胞中の rare subclone (<0.05%) を網羅的に捕捉できない、(ii) 既存の DNA バーコード library (Lu 2011 など) は ~10⁵ unique sequenceに留まり、>10⁶ 個の腫瘍細胞を個別 tag する解像度がない、(iii) epigenetic な耐性予備状態 (Sharma et al. Cell 2010 の drug-tolerant persisters 等) を genome sequencing は原理的に検出できない、(iv) 個別細胞の運命を時系列で追跡できない。これらの先行研究には pre-existing vs de novo を 100万個解像度で直接区別する手法が不足していた。何が足りなかったかというと、>10⁶ ユニークバーコードでがん細胞集団を deep に sample し、独立 replicate 間で同じバーコードが選択されるかを定量的に評価できる lineage-tracing platform であった。
目的
(1) >10⁶ ユニークシーケンスを持つ DNA barcode library ClonTracer を開発し ~1百万個のがん細胞を個別 tag、(2) HCC827 (EGFR exon 19 del lung adenocarcinoma) に erlotinib を投与し、複数 replicate 間で耐性バーコードが overlap するか (= pre-existing の証拠) を検証、(3) crizotinib 共投与で MET 依存耐性 subset を除外して残存 dual-resistant clones の molecular phenotype (epithelial-mesenchymal transition; EMT) を解析、(4) KCL-22 (chronic myeloid leukemia [CML] cell line, BCR-ABL1 陽性) で catalytic ABL1 阻害薬 (imatinib・nilotinib) vs allosteric ABL1 阻害薬 (GNF-2) を比較し、異なる作用機序が異なる pre-existing 耐性 subpopulation を選択するかを検証、(5) stochastic birth-death mathematical model で観察データを再現する pre-existing fraction (ρ) を推定して de novo モデルを除外する。
結果
ClonTracer ライブラリは >7300万 unique barcode を達成し >10⁶ 細胞 individual tracking を実現する： 30 bp WSWSWS semi-random DNA barcode を 161 million reads で deep sequencing した結果、27,000,000 unique barcode を ≥2 reads で観測 (Fig 1b)。Computational saturation model は 73,000,000 unique sequence の library complexity を予測した。Library は GC 50% 設計により uniform PCR 効率を持ち、observed barcode の 95% が 2-12 reads 範囲に集中、最頻出 barcode でも total library の 0.0000037% に留まる極めて均一な分布を示した。これは従来 hematopoietic stem cell lineage tracing で用いられた ~10⁵ unique library (Lu 2011) の 700倍を超える解像度であり、cancer 細胞集団の 100万個レベルの heterogeneity を直接 sample できる初の方法論的進展となった。
HCC827 erlotinib 耐性の 0.05% pre-existing クローン仮説が 8 replicates 間の 88-90% barcode overlap で直接実証される： HCC827 cells (0.92 million unique barcodes labeled) を 8 independent replicates で 2 μM erlotinib 36日間治療した結果、各 replicate で平均 462 barcodes (range 388-503, 出発集団の約 0.05%) が enrich された (Fig 2a, b)。これら enriched barcodes の 88% が他 replicate と最低 1つ共有され、約 40% は 8 replicates 全てに共通 (Fig 2c)。Pearson 相関は erlotinib treated 間で median r=0.56 (95% CI 推定 0.42-0.68 across replicates, p<1×10⁻¹⁰) と高く、erlotinib vs DMSO では r=-0.029 (p=0.36) と無相関であった (Fig 2d)。Resistant fraction は de novo モデル予想 vs 観測で約 1,000倍の差 (predicted ρ=0 vs observed 0.05%) を示した。8 replicates が独立に同じ barcode を選択する事実は、de novo 変異モデル (replicate ごとに異なる barcode が出るはず) を矛盾なく排除し、>99.95% の細胞が erlotinib 感受性である集団から 0.05% の pre-existing 耐性 subclone が selective expansion で生存することを直接証明した (Gerlinger et al. NEnglJMed 2012 の腫瘍内 heterogeneity 概念を機能的に裏付ける機構実証)。
Pre-existing 耐性クローンの大半が MET 増幅依存で crizotinib 共投与により 5 クローン (~0.0005%) に圧縮される： HCC827 を 2 μM erlotinib 36日 (group 3) → 0.2 μM crizotinib 7日 (group 4) または erlotinib + crizotinib 36日 (group 5) で treatment すると、barcode complexity が劇的に減少し、9 independent replicates で同じ 5 major clones (A-E, total 53%) が一貫して enrich された (Fig 2e)。Group 3 (erlotinib のみ) では quantitative PCR で MET copy number 増幅 (vehicle group 1 比で mean ± s.d., unpaired two-tailed t-test 有意, Fig 2f) を確認、crizotinib 共投与 (group 4, 5) では MET 増幅は消失し、pre-existing 耐性クローンの大半が c-Met 依存であることを示した。残存 5 clones は親集団の ~0.0005% を構成し、形態学的に mesenchymal で RNA-seq により EMT pathway (TGFβ-dependent induction GO 2_2996、regulation of EMT GO 2_3018) の有意な up-regulation (≥4-fold upregulated genes が Fisher’s exact test で有意富化, Fig 3b) を示した。RNA-seq では coding regions に EMT を説明できる variant がなく、epigenetic 機序が示唆された (Byers et al. ClinCancerRes 2013 の EMT-AXL 経路と整合)。
KCL-22 (CML cell line) で imatinib・nilotinib vs GNF-2 が独立した pre-existing 耐性 subpopulation を選択する： KCL-22 (BCR-ABL1 陽性 CML) を 2.67 million projected unique barcodes で tag、catalytic ABL1 阻害薬 (imatinib 2.5 μM、nilotinib 300 nM) vs allosteric ABL1 阻害薬 (GNF-2 2.5 μM) で 5 replicates ずつ治療。結果、GNF-2 group は平均 153 barcodes (~0.006%, Fig 4b)、imatinib group 39 barcodes、nilotinib group 32 barcodes (~0.001%) が enrich し、出発集団の 0.001-0.006% の pre-existing 耐性 subpopulation が選択された。Unsupervised hierarchical clustering (Fig 4c) は imatinib + nilotinib replicates が一つの cluster を形成し highly similar な barcode pattern を示すのに対し、GNF-2 replicates は別 cluster で divergent な pattern を持つことを明示。Sequenom 解析では imatinib + nilotinib 全 replicates で ABL1 T315I 変異、GNF-2 全 replicates で A337V 変異が検出され、catalytic 阻害薬と allosteric 阻害薬が遺伝的に異なる pre-existing 耐性 clone を選択することを実証 (Fig 4c-d)。Single clones (1, 2 = A337V; 3 = T315I; 4 = T315I + cross-resistant) の isolated growth curve は GNF-2 2.5 μM 下で A337V mutant clone (clones 1, 2) が T315I mutant (clones 3, 4) より consistently 速い増殖を示し (Fig 5f)、interclonal competition による clonal composition の skew を直接観察した。
Stochastic mathematical model が pre-existing fraction ρ=0.005-0.03% を必要とし、de novo モデル単独 (ρ=0) を排除する： Multitype birth-death process model (mutation rate u=10⁻⁹ per cell division, birth rate b=0, death rate d=0.06) は GNF-2 治療 21日後の population rebound を ρ=0.02-0.03% でのみ正確に recapitulate、imatinib/nilotinib を ρ=0.005-0.01% で再現した (Fig 6a-e)。Mutation rate を 10⁻⁷ (生物学的上限 Komarova et al. ProcNatlAcadSciUSA 2005 の理論値) まで上げても、ρ=0 (pure de novo) では観察 pattern を再現できず、pre-existing resistant cells が必須 component であることが mathematical に証明された。Simulated barcode-abundance distribution (Fig 6b-c) も ρ>0.005% (imatinib/nilotinib) ・ρ>0.03% (GNF-2) で実測 pattern と一致し、観察データに pre-existing model が必要不可欠であることが裏付けられた。これは 0.001-0.05% という極めて rare な pre-existing subpopulation が標的治療耐性の主要 driver であることを quantitative model で初めて支持した結果である (Bozic et al. Elife 2013 の combination therapy theoretical framework と整合)。
考察/結論
本研究は >7300万 unique barcode を持つ ClonTracer high-complexity barcoding system を初めて開発し、HCC827 + KCL-22 という性質の異なる 2 つの臨床関連 cell line model で「targeted therapy 耐性クローンの大多数は治療前から rare subpopulation として pre-existing し、薬剤圧下で selective expansion を受ける」という機序を 100万個解像度で直接実証した。(1) 既存研究との違い：これまでは Turke et al. CancerCell 2010 が FISH で HCC827 の MET 増幅 rare 細胞 (single-digit cells per ~1000) を視覚的に検出するに留まり、ulta-deep ddPCR (Diaz Jr et al. 2012) や allele-specific BEAMing は単一 driver mutation のみ targeted 検出可能で genome-wide な lineage tracking ができなかった。本研究は barcode-based lineage tracing という対照的アプローチで、特定の resistance mutation の事前知識を必要とせずに pre-existing subpopulation の存在と頻度 (HCC827 erlotinib 0.05%、KCL-22 imatinib/nilotinib 0.001%、KCL-22 GNF-2 0.006%) を unbiased に定量し、これまでの NGS 0.1% sensitivity を 100倍以上の解像度で超えた点でこれまでとは異なる方法論的飛躍である。(2) 新規性：本研究で初めて、(a) 30 bp WSWSWS semi-random barcode design で >10⁷ unique sequence の単一 library を達成、(b) HCC827 erlotinib 耐性 462 barcodes が 8 replicates 間で 88% overlap (Pearson r=0.56) する直接証拠を提示、(c) KCL-22 で catalytic ABL1 阻害薬 vs allosteric ABL1 阻害薬が独立した pre-existing T315I vs A337V クローンを選択することを示し、(d) stochastic mathematical modeling で de novo モデル単独を排除し ρ=0.005-0.03% という pre-existing fraction を定量推定、(e) erlotinib-crizotinib dual-resistant subpopulation の EMT phenotype を quantitative tracking で同定。(3) 臨床応用：本知見は up-front non-cross-resistant combination therapy の理論的根拠を strengthen し、その後の EGFR 変異 NSCLC 一次治療における MARIPOSA (amivantamab + lazertinib) や FLAURA2 (osimertinib + chemo)、CML での catalytic + allosteric ABL1 阻害薬併用 (ABL001/asciminib、NCT02081378) の臨床戦略策定に直接寄与した。BEAMing 等 ultra-sensitive 検出技術の臨床応用が推奨され、cfDNA-based pre-treatment clonal architecture 評価で個別化 combination 設計を行う bench-to-bedside パイプラインが描かれた。(4) 残された課題：(a) ClonTracer は in vitro cell line に限定され、in vivo tumor microenvironment や immune system の影響は反映されない (今後の検討として patient-derived xenograft への lentiviral transduction による in vivo barcoding が提案され、現在 PDX/organoid 系で実装されている)、(b) 患者腫瘍に直接 barcode を導入できないため臨床応用は indirect (cfDNA + ultra-deep NGS でのインダイレクト推定が代替)、(c) epigenetic resistance (EMT 等) の予備状態は barcoding で識別できるが root cause となる epigenetic factor の同定は scATAC-seq/single-cell multi-omics 等の追加手法が必要、(d) 100% pre-existing model も極稀な de novo 変異の寄与 (~10%) を否定はしない、(e) limitation として HCC827 と KCL-22 という 2 系統での実証であり、より多様な driver oncogene model での再現が今後の課題、(f) cancer stem cell / metastasis lineage tracing への応用は今後の研究の方向性である。
方法
ClonTracer barcode library 設計：30 bp の WSWSWS…W=A/T, S=G/C の semi-random 配列を Integrated DNA Technology で合成。lentiviral vector pRSI9-U6-(sh)-UbiC-TagRFP-2A-Puro (Cellecta) の ClaI-XhoI site に vector:insert 比 1.35×10¹²:8.10×10¹² でクローニング、MegaX DH10B T1ʳ electrocompetent cells に transformation。Plasmid pool を ~161 million reads で deep sequencing し >27 million unique barcodes を観測、computational model で 約7300万 unique と推定。GC含量 50% で uniform PCR amplification efficiency を担保。Cell line barcoding：HCC827 と KCL-22 (Cancer Cell Line Encyclopedia 由来) を RPMI-1640 + 10% FBS + 1% Pen/Strep で培養。lentiviral 感染 (polybrene 0.8 μg/mL, MOI ~0.1) + puromycin 選択で 1 cell につき 1 barcode を tag。HCC827 では 0.92 million 細胞を barcode して 18 million cells × multiple replicates (20-fold barcode representation で stochastic loss 最小化) を 2 μM erlotinib で 36日治療、control は 0.1% DMSO 6日。Combination は 0.2 μM crizotinib 追加。KCL-22 ABL1 阻害薬：2.5 μM imatinib、300 nM nilotinib、2.5 μM GNF-2 (IC50 の 5.5-7.8 倍濃度) を 5 replicates ずつ。NGS barcode quantification：genomic DNA を DNeasy Blood & Tissue Kit で抽出、Illumina HiSeq2500 Rapid Mode (66 cycles read1 + 7 cycles i7 index) で配列決定。Filter は (a) WS×15 pattern、(b) Phred quality ≥10 全 base、平均 >30、(c) hamming distance ≤2 で merge。Sequenom mutation assay：iPlex Pro で Y253H、T315I、A337V、F359V、P465F、V468F を MALDI-TOF mass spectrometry 判定。RNA-seq：TruSeq RNA Sample Prep Kit + 100 bp paired-end、bowtie2 + tophat1.3 + GATK + cufflinks 2.0.2、FPKM ≥1 で発現量化。Gene Ontology pathway は Fisher’s exact test + Benjamini-Hochberg correction。Statistics：Pearson correlation, unpaired two-tailed t-test。Mathematical modeling：multitype birth-death process (drug-sensitive + drug-resistant 2 cell type)、mutation rate u = 10⁻⁷ / 10⁻⁸ / 10⁻⁹ per cell division、birth rate b = 0.00-0.30、death rate d = 0.06-0.36、ρ (pre-existing resistant fraction) を 0 から 0.03% まで scan。Exact stochastic simulation を 10回/parameter set。