- 著者: Antonio Marzio, Emma Kurz, Jennifer M. Sahni, Giuseppe Di Feo, Joseph Puccini, Shaowen Jiang, Carolina Alcantara Hirsch, Arnaldo A. Arbini, Warren L. Wu, Harvey I. Pass, Dafna Bar-Sagi, Thales Papagiannakopoulos, Michele Pagano
- Corresponding author: Antonio Marzio, Thales Papagiannakopoulos, Michele Pagano (Laura and Isaac Perlmutter NYU Cancer Center, New York University Grossman School of Medicine, New York, NY, USA)
- 雑誌: Cell
- 発行年: 2022
- Epub日: 2021-12-27
- Article種別: Original Article
- PMID: 34963055
背景
非小細胞肺癌 (NSCLC) は、世界中のがん関連死の主要な原因であり、その約85%を占める。近年、免疫チェックポイント阻害剤 (ICB) は、NSCLCを含む多くの腫瘍タイプで持続的な抗腫瘍免疫応答を誘導し、有望な治療法として浮上している。Ribas et al. Science 2018は、ICBの有効性とその限界について報告している。NSCLCは高い腫瘍変異負荷 (TMB) を特徴とし、これはICBへの良好な応答を予測するバイオマーカーとして期待されている。しかし、進行NSCLC患者の大部分はICBに対して原発性抵抗性を示すことが課題として残されている。
主要な肺がんドライバー遺伝子の一つであるKEAP1は、NSCLC患者の約20%に変変異が認められ、肺腺癌 (LUAD) において3番目に高頻度に変異する遺伝子である。Cancer et al. Nature 2014による包括的なゲノムプロファイリングでも、その重要性が示されている。KEAP1は、CRL3 (Cullin-3-RING) ユビキチンリガーゼの基質受容体として、NRF2を恒常的に分解し、レドックス恒常性を制御する。KEAP1とNRF2の変異は類似した特徴を示すと一般的に考えられているが、KEAP1変異NSCLCのみがT細胞炎症性遺伝子発現プロファイル (GEP) スコアと有意な負の相関を示し、NRF2変異ではそのような相関は認められない。Cristescu et al. Science 2018は、PD-1チェックポイント阻害に基づく免疫療法におけるパントゥーマーゲノムバイオマーカーについて詳細に分析し、KEAP1変異の重要性を強調している。KEAP1変異は、免疫細胞浸潤の低下、免疫回避、およびICB抵抗性と特異的に相関することが報告されており、KEAP1がNRF2非依存的な抗腫瘍免疫制御機能を持つ可能性が示唆されている。
過去10年間で、相同組換え修復 (HRR) 欠損腫瘍の治療のために、合成致死アプローチが開発されてきた。その一つが、主要なDNA修復酵素であるPARP1の薬理学的阻害である。PARP阻害剤 (PARPi) は、BRCA1/2遺伝子に変異を持つ卵巣癌および乳癌の治療に承認されているが、BRCA変異がないにもかかわらずBRCAness表現型を示す他の腫瘍への適応拡大が模索されている。EMSY (EMSY transcriptional repressor) は、卵巣癌などで頻繁に増幅される癌原遺伝子産物であり、BRCA2と物理的に相互作用してその活性を阻害し、BRCAness表現型を誘導することが知られている。さらに、EMSYはいくつかのクロマチンリモデリング複合体の一部であり、インターフェロン刺激遺伝子 (ISG) の負の転写制御因子として、I型インターフェロン (IFN) 応答を抑制する。抗腫瘍免疫応答は、I型IFNを含む損傷関連分子パターン (DAMP) を活性化し、自然免疫と適応免疫応答を橋渡しする重要な因子である。
しかし、KEAP1変異NSCLCにおける免疫回避の具体的な分子メカニズムは未解明であり、KEAP1がEMSYを分解することで、HRR、IFN応答、および免疫応答の3軸を同時に制御するという仮説を直接検証した研究はこれまで存在しなかった。KEAP1変異NSCLCがICB抵抗性を示す分子基盤を解明し、新たな治療戦略を開発するための基礎的知見が決定的に不足している。
目的
本研究の目的は、KEAP1がCRL3 (Cullin-3-RING) ユビキチンリガーゼを介したユビキチン分解の標的としてEMSY (EMSY transcriptional repressor) を同定し、KEAP1変異NSCLCにおけるEMSYの蓄積が、HRR (homologous recombination repair) 欠損によるBRCAness表現型 (高TMB、PARP阻害剤感受性) と、I型インターフェロン (IFN) 応答の抑制による免疫回避を同時に引き起こす分子メカニズムを解明することである。さらに、KEAP1変異NSCLCに対するPARP阻害剤およびSTING (stimulator of interferon genes) アゴニストの単独または併用療法の治療的有効性を評価し、新たな治療戦略を確立することを目指す。
結果
KEAP1変異NSCLCにおけるTMB増加とHRDスコア上昇: TCGAデータベースのNSCLC患者データ解析により、KEAP1変異腫瘍は非喫煙者群で最高のTMBを示し、喫煙者群でも3番目に高いTMBを示した。これは、NRF2変異腫瘍では観察されなかった。KEAP1変異はTP53の状態に依存せずTMBの上昇と相関した。KPK (Kras^LSL-G12D; Trp53^flox/flox; Keap1^-/-) マウス細胞株は、KP細胞と比較してWESで約3.0-fold increase（3倍）のTMB上昇を示し (Figure 1D, n=6 replicates, p<0.01)、RNA-seqデータでもTMBの増加が確認された (Figure 1E)。GSEAでは、KPK腫瘍でHRRおよびDSB (double-strand break) 修復経路の遺伝子セットが下方制御されていることが示された (Figure 1F, n=6 replicates, p<0.01)。また、TCGAデータでは、KEAP1変異NSCLCがHRDスコアの有意な上昇を示した (Figure 1G, p<0.001)。
KEAP1欠損によるPARP阻害剤感受性の増強: KEAP1欠損細胞は、DR-GFPレポーターアッセイでHRR効率が有意に低下し (Figure 2A, n=3 replicates, p<0.01)、NCS誘導Rad51フォーカス形成およびクロマチンローディングが障害されたが、pH2axリン酸化は正常であった (Figure 2B)。KPK細胞はPARP阻害剤 (talazoparib) に対し用量依存的な感受性を示し (Figure 2C, IC50 10 nM vs 100 nM)、KEAP1の再導入によりPARP阻害剤感受性が回復した。非分解型Nrf2の発現やNrf2活性化剤の投与ではPARP阻害剤感受性は増加せず、KEAP1の機能がNRF2非依存的であることが示唆された。PDXモデルにおいても、KEAP1変異LUAD由来腫瘍はPARP阻害剤に感受性を示し (Figure 2F, 2G, p<0.05)、同所性移植KPK腫瘍はPARP阻害剤治療により腫瘍増殖が抑制され、生存期間が延長した (Figure 2H, 2I)。in vivo実験では、皮下移植したKPK腫瘍はPARP阻害剤に対して高い感受性を示した (Figure 2D, 2E, n=10 mice, p<0.01)。
CRL3^KEAP1によるEMSYのユビキチン分解制御: FLAG-KEAP1の免疫沈降-質量分析により、EMSYがKEAP1複合体の一部として同定された (Figure S3A)。KEAP1変異体はEMSYとの結合が低下し、プロテアソーム阻害剤MG132またはCRL阻害剤MLN4924処理によりEMSYが蓄積した (Figures S3E, S3F)。KEAP1欠損U2OS細胞およびKPK細胞ではEMSY蛋白質レベルが高く (Figure 3E, 3F, 3G)、KEAP1の再導入によりEMSYレベルが低下した (Figure 3H)。H2O2による酸化ストレスはEMSYの一過性蓄積を誘導したが、KEAP1欠損細胞ではEMSYの基礎レベルが高く、変動しなかった (Figure 3I)。KEAP1はEMSYのユビキチン化を誘導し、このユビキチン化はMLN4924により阻害された (Figure 3J)。EMSYのEEGEモチーフ (871-874位) がKEAP1結合デグロンとして同定され、このモチーフのアラニン置換変異体EMSY(EEGE/AAAA)は非分解性であり、Rad51フォーカス欠損とPARP阻害剤感受性を付与した (Figure 4A, 4B, 4C)。in vivoにおいて、KPK腫瘍でのEmsyサイレンシングはPARP阻害剤感受性を回復させ、pH2ax蓄積を消失させた (Figure 4F, 4G, S4H)。ヒトNSCLC組織のIHC解析では、KEAP1変異腫瘍でEMSY蛋白質レベルが高く、wild-type腫瘍で低いことが確認された (Figure 3K, p<0.001)。この解析にはKEAP1変異腫瘍n=12 samples、wild-type腫瘍n=20 samplesが用いられた。
EMSY蓄積によるI型IFN応答の強力な抑制: KPK腫瘍では、DSB修復/HRR経路が下方制御されるだけでなく、IFNシグネチャーも下方制御されていた (Figure S5A)。KPK腫瘍におけるEmsyサイレンシングは、IFNシグネチャーおよび自然免疫シグネチャーを上方制御し、ISREおよびIRF (interferon-regulatory factors) 結合遺伝子セットが最も上位に濃縮された (Figure 5A, 5B, 5C, n=3 replicates, p<0.01)。TCGAのKEAP1変異NSCLC患者データでも、IFNα応答、炎症応答、IRF制御遺伝子が下方制御されていることが示された (Figure 5D, p<0.01)。poly(G:C)刺激により、KP細胞ではKeap1依存的にEmsyが分解され、ユビキチン化およびKeap1結合が増加したが、Keap1欠損細胞ではユビキチン化が消失した (Figure 5E, 5F, S5F)。KPK細胞では、Ifnαおよびpoly(G:C)誘導ISRE活性化が大幅に減少し (Figure 5G, 5H, n=3 replicates, p<0.001)、cGAS/STING/TBK1リン酸化は正常であったが、IRF3の核内移行およびリン酸化が障害された (Figure 5E, S5H, S5I)。Keap1の再導入により、KPK細胞におけるIfnαのmRNA発現および分泌が回復した (Figure 5I, 5J, n=3 replicates, p<0.01)。非分解型Nrf2変異体はIFN応答に影響を与えなかったが、非分解型Emsyを安定発現するKP細胞ではpoly(G:C)誘導Ifnα発現/分泌が障害され (Figure 6A, n=3 replicates, p<0.01)、KPK細胞でのEmsyサイレンシングはIfnα発現を回復させた (Figure 6B, n=3 replicates, p<0.01)。
KEAP1変異腫瘍の免疫回避におけるEmsyの役割: 免疫不全NSGマウスでは、shEmsy KPK腫瘍の増殖はshCTRL腫瘍と同等であったが、免疫正常C57BL/6JマウスではshEmsy KPK腫瘍の増殖が有意に抑制された (Figure 6C, 6D, n=10 mice, p<0.01)。これは、Emsyサイレンシングによる腫瘍増殖抑制効果が機能的な免疫系に依存することを示唆する。I型IFN受容体欠損マウス (Ifnar1-null) を用いた実験でも、Emsy欠損によるKPK腫瘍の増殖抑制効果は消失し、腫瘍微小環境 (TME) におけるI型IFN応答の重要性が裏付けられた (Figure 6E, 6F, n=10 mice, p>0.05)。同所性移植モデルにおいて、shEmsy KPK肺腫瘍はshCTRL KPK腫瘍と比較して増殖が抑制され (Figure 6G, p<0.01)、KPK腫瘍ではM2様マクロファージ (Cd206+) の増加とCD8+ T細胞および総白血球の減少が認められたが、Emsyノックダウンによりこれらの免疫抑制表現型が逆転し、CD8+ T細胞集団が回復した (Figure 6H, 6I, n=12 mice, p<0.05)。
STINGアゴニストによる抗腫瘍効果と免疫微小環境の活性化: STINGアゴニスト (DMXAA) の同所性KPK肺腫瘍への投与は、KPK腫瘍の増殖を有意に抑制したが、KP肺腫瘍には効果が限定的であった (Figure 7A, p<0.01)。scRNA-seq解析により、STINGアゴニスト治療はKPK腫瘍におけるM2様マクロファージや好中球といった腫瘍促進性免疫細胞集団の拡大を逆転させ、IFN誘導性樹状細胞、NK細胞、記憶T細胞、活性化T細胞といった抗腫瘍免疫細胞集団を増加させた (Figure 7B, 7C, n=3 mice/群)。FACS解析では、STINGアゴニスト投与によりKPK腫瘍における腫瘍浸潤T細胞の割合と骨髄系細胞におけるpTbk1発現が増加した (Figure 7D, 7E, p<0.01)。STINGアゴニストとPARP阻害剤の併用療法は、KPK腫瘍の増殖をさらに抑制し、アポトーシス細胞死の増加と関連していた (Figure 7F, 7G, S7F, n=10 mice, p<0.001)。
考察/結論
先行研究との違い: 本研究は、KEAP1変異が単にNRF2の安定化を介した酸化ストレス応答のみを制御するという従来の定説と異なり、KEAP1が相同組換え修復 (HRR) とI型インターフェロン (IFN) 応答を同時に制御する多機能なハブとして機能していることを明らかにした。NRF2変異腫瘍ではTMBの上昇や免疫抑制表現型が見られないのに対し、KEAP1変異腫瘍特有の現象としてEMSYの安定化が関与していることを示した点は、これまでの知見と対照的である。
新規性: 本研究で初めて、KEAP1のNRF2非依存的基質としてEMSYを新規に同定した。KEAP1がCRL3ユビキチンリガーゼを介してEMSYのEEGEデグロンモチーフを認識し、その分解を動的に制御していることを突き止めた。KEAP1欠損に伴うEMSYの蓄積が、BRCA2阻害を介した相同組換え修復欠損 (BRCAness) と、IRF3の核内移行阻害を介したI型IFN応答抑制という、ゲノム不安定性と免疫回避を同時に駆動する二重のプロオンコジェニックな表現型を引き起こすという新規の分子メカニズムを実証した。
臨床応用: 本知見は、KEAP1変異を有する難治性NSCLC患者に対する新たな治療戦略の臨床応用に直結する。KEAP1変異によって生じるBRCAness表現型を逆手に取ったPARP阻害剤の治療転用、およびEMSY蓄積によって抑制されたI型IFN応答を強制的に活性化するSTINGアゴニスト療法の臨床的有用性が示された。特に、PARP阻害剤による腫瘍細胞死の誘導と、STINGアゴニストによる腫瘍微小環境の免疫活性化を組み合わせた併用療法は、極めて強力な相乗効果を発揮し、臨床現場における新たな標準治療となる可能性を秘めている。
残された課題: 今後の検討課題として、EMSYがcGAS-STING経路の下流でIRF3のリン酸化および核内移行を阻害する具体的な分子間相互作用の全貌解明が挙げられる。また、本研究のlimitationとして、マウス同種移植モデルおよびPDXモデルにおける検証にとどまっているため、実際のKEAP1変異NSCLC患者を対象とした臨床試験において、PARP阻害剤とSTINGアゴニストの併用療法の安全性と有効性を検証することが今後の重要な研究方向性である。
方法
患者データ解析: TCGA (The Cancer Genome Atlas) のNSCLC (LUAD, LUSC) 患者データを用いて、KEAP1変異状態別にTMB (腫瘍変異負荷)、HRD (相同組換え欠損) スコア、およびIFNシグネチャーを比較解析した。喫煙者と非喫煙者の両群でTMB分布を評価した。線形回帰分析はGraphPad Prism 7ソフトウェアのカイ二乗検定で行われた。
マウスモデル: Romero et al. NatMed 2017で報告されたKP (Kras^LSL-G12D; Trp53^flox/flox) 遺伝子改変マウスモデル (GEMM) 由来の細胞株を使用し、CRISPR/Cas9システムを用いてKeap1をノックアウトしたKPK (Kras^LSL-G12D; Trp53^flox/flox; Keap1^-/-) クローンを作製した。これらの細胞株のTMBは全エクソームシーケンス (WES) およびRNAシーケンス (RNA-seq) で評価し、HRR経路の遺伝子発現プロファイルをGSEA (Gene Set Enrichment Analysis) で解析した。
HRRアッセイ: DR-GFP U2OSレポーターアッセイを用いてHRR効率を測定した。DNA損傷剤であるネオカルチノスタチン (NCS) 処理後のRad51フォーカス形成およびクロマチンローディング、pH2ax (Ser139) 染色を評価した。
PARP阻害剤感受性評価: PARP阻害剤 (talazoparib, olaparib, veliparib, PJ34) に対する細胞株のin vitro感受性をalamarBlueアッセイで評価した。in vivoでは、皮下移植モデルおよび同所性肺移植モデル (C57BL/6Jマウス、n=10 mice/群) を用いて、talazoparibの抗腫瘍効果と生存期間を評価した。さらに、患者由来異種移植 (PDX) モデル (CTG-465: KEAP1変異、CTG-1194: ATM変異、CTG-743: wild-type) を用いて、PARP阻害剤感受性を検証した。統計解析にはStudent’s t検定およびKaplan-Meier法による生存分析 (log-rank検定) を用いた。
EMSY-KEAP1相互作用: HEK293T、U2OS、KP細胞にFLAG-KEAP1およびEMSYを共発現させ、プロテアソーム阻害剤MG132またはCRL阻害剤MLN4924処理下で、免疫沈降-質量分析 (IP-MS) およびウェスタンブロットにより相互作用を解析した。EMSY EEGEモチーフ (871-874位) のアラニン置換変異体 (EMSY(EEGE/AAAA)) を作製し、その分解抵抗性とHRRおよびPARP阻害剤感受性への影響を評価した。ヒトNSCLC組織におけるKEAP1変異とEMSY蛋白質発現レベルの相関を免疫組織化学 (IHC) で解析した (KEAP1変異n=12 samples、wild-type n=20 samples)。
IFN応答評価: poly(G:C)またはpoly(ISD)刺激によるI型IFN応答を、ISRE (interferon-stimulated response element) ルシフェラーゼレポーターアッセイ、phospho-Sting/Tbk1/Irf3のウェスタンブロット、およびIFNα/ISG (Ccl5, Cxcl10, Isg15, Isg54, Isg56) のmRNA発現 (qRT-PCR) および分泌 (ELISA) で評価した。IRF3の核内移行とリン酸化の障害を免疫蛍光染色で解析した。
免疫系依存性評価: shEmsyを導入したKPK腫瘍のin vivo増殖に対する免疫系の影響を、免疫不全マウス (NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl/SzJ、NSGマウス) と免疫正常マウス (C57BL/6Jマウス) への皮下移植モデルで比較した。また、I型IFN受容体ノックアウトマウス (Ifnar1^tm1.2Ees/Jマウス) を用いて、腫瘍微小環境 (TME) におけるI型IFN応答の役割を評価した。
STINGアゴニストin vivo: STINGアゴニスト (diABZI, DMXAA) を同所性KPKマウスに投与し、抗腫瘍効果を評価した。10xシングルセルRNAシーケンス (scRNA-seq) およびフローサイトメトリー (FACS) により、TMEにおける免疫細胞浸潤と活性化マーカー (Cd206+, Cd8+, pTbk1, pIrf3) の変化を解析した。STINGアゴニストとPARP阻害剤の併用療法の効果も評価した (n=10 mice/群)。
統計解析: 全てのデータはGraphPad Prism 9を用いて解析された。2群間の比較にはStudent’s t検定が用いられた。