- 著者: Fiona Blackhall, Kristopher K. Frese, Kathryn Simpson, Elaine Kilgour, Gerard Brady, Caroline Dive
- Corresponding author: Caroline Dive (Cancer Research UK Manchester Institute, University of Manchester, Manchester, UK)
- 雑誌: The Lancet Oncology
- 発行年: 2018
- Epub日: 2018-08-08
- Article種別: Review
- PMID: 30191851
背景
小細胞肺癌 (SCLC) は肺癌全体の10〜20%を占める極めて悪性度の高い神経内分泌腫瘍であり、診断時にはすでに微小転移を伴う広範型 (extensive disease) であることが多く、2年生存率が10%未満という極めて厳しい予後をたどる。標準治療であるプラチナ製剤とエトポシドの併用化学療法は40年以上も不変であり、初回奏効率は60%前後と良好であるものの、ほぼすべての症例が1年以内に耐性を獲得して再発する。SCLCの治療成績が長年停滞している最大の要因は、腫瘍の急速な増殖と早期転移という臨床的特性に加え、診断時や再発時の組織生検が極めて困難であること、また得られる組織量が分子プロファイリングに不十分であることにある。この組織不足という決定的な「ギャップ」を克服する非侵襲的なアプローチとして、血中循環腫瘍細胞 (CTC) や循環腫瘍DNA (ctDNA) を用いた液体生検 (liquid biopsy) が注目されている。
先行研究においては、SCLCのゲノム特性に関する詳細な解析がなされており、TP53およびRB1のほぼ普遍的な不活化が報告されている (George et al. Nature 2015、Rudin et al. NatGenet 2012)。また、免疫チェックポイント阻害剤であるニボルマブ単剤およびイピリムマブとの併用療法が、一部の既治療SCLC患者に奏効を示すことが報告された (Antonia et al. LancetOncol 2016)。しかし、これらの治療法におけるバイオマーカーの同定や、治療反応性の予測メカニズムについては未解明な点が多く、特に組織生検の困難さがその進展を妨げている。SCLC患者の治療成績が長年停滞しており、新規治療法の開発が強く求められているにもかかわらず、治療標的の同定や治療効果のモニタリングに資する非侵襲的な手法が不足しているのが現状である。これらの背景から、SCLCにおける液体生検の現状と将来展望を体系的に論じることは、患者の治療成績向上に不可欠である。本レビューは、マンチェスター大学/Cancer Research UK Manchester InstituteのDive研究室を中心とした著者らが、SCLCにおける液体生検の現状と将来展望を体系的に論じたものである。
目的
本レビューの目的は、小細胞肺癌 (SCLC) における液体生検 (循環腫瘍細胞 (CTC)、循環腫瘍DNA (ctDNA)、エクソソーム) の技術的基盤、定量および分子特性評価法、予後および予測バイオマーカーとしての臨床応用可能性、特にCTC由来エクスプラント (CDX) モデルを用いた個別化創薬の可能性、そして残された課題を包括的にレビューすることである。SCLCの治療成績が長年停滞している現状において、液体生検がどのように治療戦略の改善に貢献しうるかを多角的に検討し、将来的な臨床実装に向けたロードマップを提示することを目指す。具体的には、治療反応のモニタリング、獲得耐性メカニズムの解明、個別化治療の開発、免疫療法バイオマーカーの探索における液体生検の役割を明確にすることが主要な目的である。本レビューは、SCLCにおける液体生検の臨床的有用性を評価し、その臨床実装に向けた課題と展望を提示することを意図している。
結果
SCLCのゲノム特性と治療標的の概観: SCLCは喫煙との強い関連性から高い体細胞変異量 (TMB) を有する。George et al. Nature 2015やRudin et al. NatGenet 2012らの詳細なゲノム解析により、TP53およびRB1腫瘍抑制遺伝子のほぼ普遍的な不活化が確認されている。その他、MYCファミリー遺伝子および抗アポトーシス遺伝子BCL2のコピー数増加、クロマチンリモデリング酵素、受容体型チロシンキナーゼ、NOTCHファミリー遺伝子に変異が頻繁に認められる。治療標的は免疫系、DNA損傷修復、エピジェネティクス、細胞周期、発生制御経路に分類され、DLL3を標的とするロバルピツズマブ テシリン (抗体薬物複合体) はDLL3発現と治療奏効の相関を示した。MYC増幅症例に対するAurora kinase阻害剤、SLFN11発現と相関するPARP阻害剤、WEE1阻害剤、および免疫チェックポイント阻害剤（ニボルマブ：Antonia et al. LancetOncol 2016のCheckMate 032試験でORR 10〜30%）などが開発されている。PD-L1発現はSCLC腫瘍細胞では低頻度（17%）だが、腫瘍微小環境内の免疫細胞では31〜71%と高率である。CheckMate 032の後ろ向き探索的解析では、高TMBがニボルマブ±イピリムマブへの奏効および生存改善と関連することが示されたが、組織検体の入手困難性からTMB評価は一部の患者 (n=133/245) に限られた。ctDNAやCTC由来DNAによるTMB評価は、この課題を解決し、免疫療法バイオマーカーの実用化に繋がる可能性がある。
CTC検出法の概要とSCLC固有の優位性: CTC濃縮には、EpCAM (epithelial cell adhesion molecule) 免疫磁気ビーズとCD45陰性除去を用いるマーカー依存的手法 (CellSearchシステム、FDA承認) と、細胞サイズや変形性に基づくマーカー非依存的手法 (Parsortixなど) がある (Figure 1)。SCLCは上皮マーカー (EpCAM) と神経内分泌マーカーを共発現するため、CellSearchによる検出が有効である。著者らの研究では、SCLC患者の78%でCTCが検出され、平均2915個/7.5mL (SD 8115)、中央値28個/7.5mL (範囲0〜44,896) というNSCLCの10〜100倍の豊富さが確認された。これはSCLCが液体生検に特に適していることを示唆する。ただし、一部のCTC (非神経内分泌表現型) はEpCAMを発現しないため、CellSearchでは検出されない可能性がある。
CTC数の予後意義と治療反応モニタリング: CTC数の予後意義は複数の独立した研究で確立されている。著者らの研究では、ベースラインCTC数≥50/7.5mLの患者はmOS 5.4ヶ月 (CTC<50では11.5ヶ月) と有意に短いことを示した。限局型SCLC (CONVERT試験組み入れ例) では、15 CTC/7.5mL以上の患者で2年以内の増悪・死亡リスクが100%であり、長期生存者 (2年以上) はすべてベースラインCTC<15であったと報告されている。Hiltermann et al. (n=59) は、CTC≥2/7.5mLが病期に次ぐ第二の予後因子 (OS HR 3.1、95% CI 1.4-6.6、p≤0.001) であることを示した。Zhang et al.のメタ解析 (7研究、n=440) では、CTC陽性 (≥2/7.5mL) がOS (HR 1.9、95% CI 1.19-3.04、p<0.0001) およびPFS (HR 2.6、95% CI 1.9-3.54、p<0.0001) の悪化と関連した。Naito et al.は8 CTC/7.5mL以上を最適カットオフとし、予後不良と関連することを示した (OS HR 3.5、95% CI 1.45-8.6、p=0.0014)。ベースライン前治療CTC数はOS短縮と一貫して相関し、RECIST奏効とは独立した予後情報を提供することが示されている。治療中のCTCダイナミクスも重要であり、Normanno et al. (ED-SCLC n=40) は、1サイクル目化学療法後のCTC数減少≥89%が死亡リスク低下と有意に関連 (HR 0.24、95% CI 0.09-0.61) したことを報告した。
CTCの分子解析：コピー数変異プロファイリングによる化学療法感受性分類: Carter et alは、CTCの単一細胞全ゲノムコピー数変異 (CNV) プロファイリングにより、化学療法感受性 (chemosensitive) と耐性 (chemorefractory) のSCLCを事前に分類できることを示した。化学療法耐性に分類されたCTC CNVプロファイルを持つ患者の中央生存期間は4.4ヶ月、感受性分類では7.3ヶ月と有意差があった。再発時のCTC CNVプロファイルは治療前と概ね類似しており、前治療の化学療法耐性プロファイルとは異ならなかった。このことは、これらの限られた症例において、後天的耐性が大規模なCNV変化の選択によってではなく、エピジェネティックな変化によって生じる可能性を示唆している。この知見は、液体生検による化学療法反応予測の最初の原理的証明として重要である。
CTC-derived explant (CDX) モデル：液体生検からの個別化創薬プラットフォーム: 著者らのグループはHodgkinson et alで、SCLC患者CTCを免疫不全マウス (NSGマウス) に皮下移植し、患者腫瘍の組織学的・遺伝学的・生化学的特性を忠実に再現するCDXモデルを樹立できることを初めて報告した (Figure 2)。4例のモデル (化学療法感受性・耐性の初回治療患者) から樹立されたCDXは、患者の化学療法反応性を再現した。現在、40例以上のSCLC CDXパネルが構築されており、限局型SCLC、後天的化学療法耐性、NSCLCからSCLCへの形質転換 (EGFR-TKI耐性後の小細胞癌転換、Sequist et al. SciTranslMed 2011参照) を代表するモデルが含まれている。CDXはCellSearchによるCTC数50個/7.5mL以上の患者の約55%から3〜6ヶ月以内に樹立可能である。
CDXモデルの臨床的応用として重要な知見の一つは、Gardner et alによる後天的化学療法耐性とEZH2-SLFN11軸の解明である。CDXモデルを繰り返し再治療した系で、SLFN11のダウンレギュレーションが後天的耐性発生と因果的に関連することが示された。SCLCにおけるSLFN11は、PARP阻害剤 (オラパリブなど) 感受性との相関も報告されており、CDXモデルでの検討でPARP阻害剤の効果と患者の臨床経過の一致が示された。さらに、Lallo et al. のCDX・PDX研究では、PARP阻害剤 (オラパリブ) とWEE1阻害剤 (AZD1775) の組み合わせがSCLCに対して有効であることが示された。CDXモデルはSCLCの肺・脳への転移tropismを再現しており、皮下移植CDXから自発的に肺・脳への転移が生じた (Figure 3)。これは、CDXがSCLC転移生物学研究にも有用なプラットフォームであることを示す。CDXの限界として、免疫微小環境を持たないため免疫療法の試験には不適であること、血管外薬物送達不全 (皮下モデル) の課題があり、orthotopic CDXの開発が進行中である。
ctDNA解析：SCLC治療モニタリングと耐性機序解明: SCLCのctDNA解析はいくつかの研究で評価されている。Almodovar et al. (Almodovar et al. JThoracOncol 2018、n=27) の縦断的cfDNA解析では、SCLC関連遺伝子14個のパネルでNGS解析により85%の患者で疾患関連変異が検出され、TP53変異が70%の患者で検出された。ctDNA動態は治療奏効と密に追従し、9例では画像より先立ってctDNAが再発を示した。NOTCHファミリー不活化変異 (14例中7例、52%) やMYCファミリー増幅 (4例、15%) 等の治療標的変異の同定も可能であった。Wang et al. (n=23) の研究では、545癌遺伝子のcapture deep sequencingで44の前治療ctDNAサンプルすべてで変異が検出された (中央値16変異/サンプル)。最頻変異はTP53 (91%) およびRB1 (65%) であった。特に注目すべき知見として、治療前のclonal variant allele frequency (VAF) の高さが予後不良と有意に関連しており (高VAF群のmOS 8.1ヶ月 vs 低VAF群24.9ヶ月、p=0.004)、これが病期・年齢・白金感受性から独立した予後因子であることが示された。これは、腫瘍異質性の度合いを反映するctDNA測定が臨床有用な予後情報を提供することを示唆する。Jamal-Hanjani et al. NEnglJMed 2017のNSCLC TRACERx研究でも、サブクローン変化が再発および死亡と関連することが示されている。Morgensztern et al. (GUARDANT70 70遺伝子パネル) は、240サンプルの93%で少なくとも1変異を同定した。著者ら自身の研究では、全ゲノムコピー数変異と110遺伝子標的捕捉によるctDNA解析で96%の患者で腫瘍関連変化が検出され、並行CTC解析では76%で少なくとも1 CTCが検出された。染色体不安定性スコア (CNI score) を全ゲノムctDNA解析で算出する方法 (Newman et al. NatMed 2014の追試) も開発されており、免疫療法を受けたがん患者 (肺癌5例以上を含む) でCNIスコアがRECIST応答と相関することが示された。
一方、現状の課題として、ASCO/CAPの共同レビュー(Merker et al. JClinOncol 2018)は、一部のctDNAアッセイには臨床的妥当性が示されているものの、多くの場合、進行癌における臨床的有用性はいまだ証明されていないと結論付けており、研究と標準化された臨床実装との間に大きなギャップがあることが強調されている。
CTCの短期培養・CTC培養系 (primary cultures): マウスモデルは樹立に3〜6ヶ月かかるため、数週間で樹立可能な短期primary culturesが、アバターモデルとして患者治療意思決定支援に向けて開発中である。いくつかのSCLC CTC培養系が報告されており、5例のCTC細胞株で4種の化学療法に対する感受性差を示す研究などが進められている。腫瘍細胞量が豊富な場合 (胸水等) は、dynamic BH3 profilingやmass accumulation rate測定 (約100細胞で可能) 等の機能的アッセイが実施可能と期待される。ただし、無限増殖CTC cell lineの樹立はin vitro適応による不可逆的転写変化 (FGFR3等) を生じる可能性があり、短期培養と長期継代細胞株は補完的アプローチとして使い分けるべきとされた。
免疫療法バイオマーカーとしての液体生検の役割: SCLCでは腫瘍 PD-L1発現が低く (5〜20%)、TMBが有望なバイオマーカーとして探索されている。CheckMate 032の後ろ向き探索解析でhigh TMB (腫瘍組織WES) がニボルマブ±イピリムマブ奏効・生存改善と関連したが、WESに利用できた症例は全体の50〜54%に過ぎなかった。CTCやctDNAによるTMB評価はこのギャップを埋める可能性がある。また、CTC上のPD-L1・CTLA-4・MHC-I発現の評価、CTCやctDNAを用いたネオアンチゲン評価も免疫療法予測バイオマーカーとして探索されている。CDXモデルそのものは免疫微小環境を持たないため免疫療法の直接評価には不適だが、humanized mouseモデルとの組み合わせ等が検討されている。
エクソソームおよびその他の循環バイオマーカー: 液体生検としてのエクソソームの研究はCTCおよびctDNAに比べてまだ初期段階にある。SCLC由来エクソソームのmiRNAプロファイル、circulating free RNA、エクソソームタンパク質バイオマーカーが報告されており、SCLC検出・病期判定・予後予測の可能性が示唆されている。ctDNAメチル化パターン (SHOX2、RASSF1A等) によるSCLC検出も探索されている。
考察/結論
SCLCは高いCTC数とctDNA量を持つという固有の特性から、液体生検の臨床応用に最も適した癌種の一つである。本レビューは、①予後・予測バイオマーカー (CTC数・ctDNA変動)、②治療モニタリング・早期再発検出、③CDXモデルによる個別化治療開発 (SLFN11・PARP阻害剤・Aurora阻害剤・オラパリブ+AZD1775等)、④免疫療法バイオマーカー開発 (TMBの液体生検評価) という4軸でSCLCにおける液体生検の可能性を体系的に提示した先駆的文書である。
先行研究との違い: 本研究は、従来のレビューが個々のバイオマーカーの解説に留まっていたのに対し、CTCからのCDX (CTC-derived explant) モデル樹立という当時新しいプラットフォームを包括的レビューの中心軸に置き、患者治療と前臨床研究の橋渡しとしての液体生検の機能を体系的に論じた点で、これまでの報告と異なる。特に、Hodgkinson et alで示されたCDXモデルの樹立とその臨床的関連性の検証は、SCLC研究における新たなパラダイムシフトを示唆するものであった。
新規性: 本レビューは、SCLCの治療成績が長年停滞している状況において、液体生検が個別化医療の実現に向けた強力なツールとなりうることを新規に提示した。特に、患者CTCから直接マウスモデルを作製して治療薬感受性を検証し、その結果を患者治療に反映するという精密医療サイクルの実現可能性を示した点は、これまで報告されていないアプローチである。また、Carter et alによるCTCのCNVプロファイリングを用いた化学療法感受性予測の概念実証は、液体生検が治療選択をガイドする可能性を初めて示した。
臨床応用: 本知見は、SCLC患者の治療成績向上に直結する臨床応用への大きな可能性を秘めている。腫瘍生検が困難なSCLCにおいて、液体生検は治療反応のモニタリング、早期再発の検出、個別化治療の開発、免疫療法バイオマーカーの探索に極めて有用である。例えば、CTC数やctDNA動態は予後予測や治療効果判定に役立ち、CDXモデルは新規薬剤開発や耐性メカニズム解明のための強力なプラットフォームとなる。これらのアプローチは、SCLCの治療成績を改善し、患者の予後を向上させる臨床的意義を持つ。
残された課題: 今後の検討課題として、液体生検の標準化された前処理条件と解析ワークフローの確立が挙げられる。特に、ctDNAアッセイの臨床的有用性を証明するための多施設前向き介入試験の実施が最重要である (Merker et al. JClinOncol 2018)。CDXモデルの普及化と個別化治療試験への応用、SCLC分子サブタイプ (ASCL1/NEUROD1/POU2F3/YAP1/INFLAMED型) の液体生検による分類も今後の研究方向性として残されている。さらに、免疫微小環境を考慮した免疫療法バイオマーカーの液体生検による評価も、今後の重要な課題である。また、エクソソームを含むその他の循環バイオマーカーの臨床的意義の確立も今後の研究が待たれる。
方法
本論文はレビュー記事であるため、特定の実験的手法は新規に実施されていない。著者らは、PubMedデータベースを用いて、2018年5月1日以前に公開された英文文献を網羅的に検索した。検索キーワードには「circulating tumour cells」「small cell lung cancer」「liquid biopsies」「biomarker directed therapy」「ctDNA」「mutational burden」「lung cancer」などが使用された。SCLCにおける循環バイオマーカーに関する臨床報告が少ないため、2018年の米国臨床腫瘍学会 (ASCO) 年次会議で発表された関連演題もレビュー対象に含められた。さらに、ClinicalTrials.govデータベースを用いて、「small cell lung cancer」および「biomarker directed therapy」のキーワードを含む臨床試験が検索された。これらの検索により得られた文献に基づき、SCLCにおける液体生検の現状、技術的側面、臨床的有用性、および将来的な展望について体系的な分析と議論が行われた。
特に、CTCおよびctDNAの検出・解析技術、それらの予後および治療予測における意義、CTC由来エクスプラント (CDX) モデルを用いた前臨床薬物開発、および免疫療法バイオマーカーとしての応用可能性に焦点が当てられた。レビューの過程では、各バイオマーカーの検出限界、解析の課題、標準化の必要性についても言及された。本レビューの対象文献の選択においては、SCLCにおける液体生検の臨床的有用性および前臨床研究への応用可能性に関するエビデンスレベルの高い研究が優先的に含まれた。検索された文献は、その内容と関連性に基づいて評価され、SCLCの診断、治療モニタリング、予後予測、および新規治療開発における液体生検の役割を包括的にカバーするように選択された。本レビューは、特定の統計手法を用いたメタ解析ではなく、既存の文献を統合し、SCLCにおける液体生検の全体像を提示する narrative review の形式で実施された。