- 著者: Pietro Scaparone, Alessia Mira, Taek-Chin Cheong, Enrico Patrucco, Biagio Ricciuti, Riccardo Gribaudo, et al.
- Corresponding author: Chiara Ambrogio (Molecular Biotechnology Center, University of Torino); Roberto Chiarle (Boston Children’s Hospital, Harvard Medical School)
- 雑誌: Cancer Discovery
- 発行年: 2026
- Epub日: N/A
- Article種別: Original Article
- DOI: N/A
背景
KRAS 変異は全ヒトがんの中で最も頻度の高い発がんドライバーの一つであり、とりわけ肺腺癌 (LUAD) において KRAS G12C 変異は重要な治療標的として注目されてきた (Kim et al. Cell 2020)。FDA は KRAS G12C 選択的共有結合阻害薬である sotorasib および adagrasib を承認し、長年「undruggable」とされてきた KRAS 標的療法のドグマが打破された。しかし、第 3 相試験である CodeBreak200 および KRYSTAL-12 では、sotorasib の客観的奏効率 (ORR) は 28.1%、adagrasib は 32% にとどまり、いずれも docetaxel に対するわずかな PFS 改善しか示せなかった (Arbour et al. ClinCancerRes 2021)。
獲得耐性のメカニズムとしては、KRAS G12C 二次変異（スイッチ II ポケット変異）、KRAS G12C 遺伝子増幅、適応的なフィードバックシグナル活性化、EGFR/MET/FGFR 活性化など多岐にわたる変異が報告されてきた。一方で、KRAS 変異と ALK 融合は NSCLC において通常 mutually exclusive と見なされており、両者の共存は過剰な発がんシグナルによる負の選択を受けると考えられていた (Skoulidis et al. CancerDiscov 2015)。しかしながら、KRAS 阻害薬治療後の耐性腫瘍における ALK 融合の獲得が散発的に報告されはじめており、その発生メカニズムと治療的意義は未解明であった。特に、ALK 融合が KRAS G12C 阻害をどのようにバイパスするか、また KRAS 阻害薬の持続的な選択圧がシグナル経路をどのように再配線するかについて、系統的な前臨床的解析と治療戦略の検証が不足していた (Adachi et al. ClinCancerRes 2020)。
目的
KRAS G12C 阻害剤耐性における EML4-ALK 融合獲得のメカニズムを臨床症例と前臨床モデルで解明し、この耐性を克服するための合理的な治療戦略を同定する。具体的には、(1) 患者での EML4-ALK 獲得耐性の検証、(2) CRISPR ベースの dual KRAS G12C/EML4-ALK 前臨床モデルの構築、(3) 持続的 KRAS 阻害圧力によるシグナル再配線の機序解明、(4) 野生型 RAS 経路を介したバイパスメカニズムの同定、(5) RAS(ON) 多選択的阻害薬を含む多段階治療戦略の in vivo 検証を行う。
結果
臨床症例：KRAS G12C 阻害剤耐性時の ALK 融合獲得：
41 歳女性の KRAS G12C 変異肺腺癌患者（PD-L1 陰性）は、カルボプラチン/ペメトレキセド + pembrolizumab 1 次治療後に adagrasib の第 I/II 相試験（用量漸増コホート）へ移行した。adagrasib 投与により RECIST v1.1 で 27% の腫瘍縮小を達成し、約 8 ヶ月間の奏効を維持したが、その後に脳転移を含む疾患進行をきたした。剖検時に採取した肺腫瘍 3 ヶ所・縦隔リンパ節・脳転移の多点サンプリングから次世代シーケンス (NGS) を施行したところ、肺腫瘍の 3 サンプルで獲得 EML4-ALK 融合（イントロン 19 再配列）と MAP3K1 機能喪失変異（c.1625_1631del, p.T542Mfs*13）が同定された。縦隔リンパ節では KRAS G12C 高レベル増幅（23 コピー）が追加で検出された。脳転移には明確な耐性機序は認められなかった（Fig 1A, 1B）。63 歳男性の KRAS G12C 変異肺腺癌患者（PD-L1 ≥50%）はクローン病・潰瘍性大腸炎のため免疫療法が禁忌とされ、adagrasib 第 I/II 相試験に登録されて 15 ヶ月以上の奏効を維持した後に進行し、液性生検にてGRIP and coiled-coil domain containing 2 遺伝子（GCC2）を融合パートナーとする GCC2-ALK 融合と MYC・B-cell lymphoma 2 like 1（BCL2L1/Bcl-xL）増幅の獲得が確認された（Suppl. Fig 1B, 1C）。この 2 症例は SPARK 試験（NCT05272423）の一環として解析された。
CRISPR-FACTS による EML4-ALK 融合ライブラリーの同定と in vitro 耐性モデルの構築：
adagrasib 耐性 H23・H358 KRAS G12C 肺腺癌細胞株に対して、CRISPR/Cas9 で ALK イントロン 19 に DNA 二本鎖切断を導入し、functionally active chromosomal translocation sequencing (FACTS) 法を適用したところ、最も頻度の高い融合として EML4-ALK variant 3a/b（E6;A20）が同定され、variant 5a（E2;A20）や E21;A20 なども検出された（Fig 1C）。H23・H358 の dual KRAS G12C/EML4-ALK クローンは親株に比べて増殖速度が低下しており（2 つの oncogene の共存による過剰 MAPK シグナル毒性）、その増殖障害は低濃度の alectinib で部分的に回復した（Fig 1D, Suppl. Fig 3A）。single-agent（adagrasib または alectinib/lorlatinib）に対しては dual クローンは耐性を示したが、adagrasib + alectinib の合剤では in vitro 相乗効果（Zero Interaction Potency法、ZIP 法）が確認され、IncuCyte live-cell imaging でも 5 日間の成長抑制が示された（Suppl. Fig 3D, E, F）。In vivo では H23 KRAS G12C/EML4-ALK 細胞を免疫不全 NOD-scid-gamma マウス（NSG 雌、6 週齢）に皮下注入し、n=5 の 4 群（vehicle/adagrasib/alectinib/合剤）で treatment を行ったところ、単剤では有意な抗腫瘍効果が得られなかったが、合剤では顕著な腫瘍体積減少が認められた（Suppl. Fig 4C）。合剤群で Ki67 陽性細胞の割合が有意に低下した（Suppl. Fig 4D）。
KRAS G12C 阻害薬による持続的圧力が ALK 依存性へのシグナル再配線を誘導：
dual KRAS G12C/EML4-ALK 細胞（H23・H358）を adagrasib 1 μM で 4 週間にわたって継続処置（long treatment: LT）したところ、驚くべきことに単剤 ALK 阻害薬（alectinib）に対する感受性が新たに獲得された（Fig 2A, 2B）。IncuCyte imaging で alectinib 0.1 μM 単剤による有意な増殖抑制が確認され、alectinib + adagrasib 合剤との効果は同等に近いものであった（Fig 2C, Suppl. Fig 5B）。ウエスタンブロットでは、adagrasib-LT dual 細胞において alectinib 単剤が pERK・phospho-MEK (pMEK) の低下とアポトーシス促進因子 BIM の上昇を誘導し、RAS-GTP pull-down では alectinib 単剤による RAS-GTP 有意減少が示された（Fig 2D, 2E）。In vivo 実験では H358 KRAS G12C/EML4-ALK LT 細胞を皮下移植したマウス（n≥3、10 mg/kg/日）で、alectinib 単剤が adagrasib + alectinib 合剤に近い抗腫瘍効果を示した（Fig 2F, Suppl. Fig 5C）。KRAS G12D/EML4-ALK（KP マウス細胞、A427 ヒト細胞）や KRAS G12C/CCDC6-RET モデルでも同様のシグナル再配線が確認された（Suppl. Fig 6, 7）。
EML4-ALK は野生型 RAS (H/N RAS) を介して KRAS G12C 阻害をバイパスする：
野生型 KRAS アレルが欠損した KRAS G12C 細胞株（H2122・H1373）に doxycycline 誘導性 KRAS WT を外来導入し、EML4-ALK と同時発現させた検証系（H2122 ALK-doxyKRAS WT）を用いた解析から、EML4-ALK は KRAS G12C 阻害下において野生型 RAS の GTP ローディングを増加させることが示された（Fig 3D）。H/N/KRAS の siRNA 三重ノックダウンは増殖を有意に抑制し（p<0.05）、pan-RAS 阻害薬の効果を模倣した（Fig 3E）。また KRAS G12C 阻害下で M-RAS がん遺伝子ホモログ（MRAS）の基礎発現が代償的に増加し、三重ノックダウン時に最も顕著となった。pan-KRAS(OFF) 阻害薬 BI-2865 は dual KRAS G12C/EML4-ALK 耐性細胞では効果が減弱したが、RAS(ON) 多選択的阻害薬 RMC-7977（Revolution Medicines）は dual 細胞でも活性を維持し（Fig 3A）、SHP2 阻害薬 RMC-4550 との相乗効果がウエスタンブロット（pERK・phospho-S6 の完全消失）でも確認された（Fig 3B, 3C）。RMC-7977 の活性維持は KRAS G12C WT アレル欠損細胞（H2122・H1373）や H3122-KRAS G12C 細胞でも一貫していた（Suppl. Fig 11A, 11B）。
多アーム in vivo 延長試験：RMC-7977 + alectinib の持続的抗腫瘍効果：
H358 KRAS G12C/EML4-ALK LT 細胞を用いた 90 日間の多アーム in vivo 試験（n≥3、adagrasib/alectinib/RMC-7977 各 10 mg/kg/日）では、単剤 alectinib は 60 日目まで adagrasib + alectinib 合剤と同等の効果を示したが、その後に再燃が認められた。一方、RMC-7977 + alectinib 合剤は全ての治療ラインにわたって一貫した腫瘍安定化・退縮を達成し（Fig 4A-C）、adagrasib → alectinib → adagrasib の逐次治療コホートでは adagrasib 再投与への感受性は回復しなかったが、RMC-7977 + alectinib には強固な奏効が維持された（Suppl. Fig 11E）。
考察/結論
本研究は、KRAS G12C 阻害剤（adagrasib）耐性として ALK 融合が獲得されるメカニズムを、臨床症例と系統的な前臨床モデルを組み合わせて初めて詳細に解明した。
① 先行研究との違い：これまで KRAS 変異と ALK 融合は NSCLC において mutually exclusive であると考えられており（Skoulidis et al. CancerDiscov 2015)、共存は過剰な発がんシグナルによる負の選択を受けると理解されてきた。本研究はこれと異なり、選択的 KRAS G12C 阻害薬による治療圧力が「mutually exclusive」な ALK 融合を獲得させ、さらに持続的 KRAS 阻害によって腫瘍がシグナルを ALK 依存性に再配線するという動的プロセスを明らかにした。既存の耐性メカニズム解析（Adachi et al. ClinCancerRes 2020)と対照的に、本研究では上皮間葉移行ではなく oncogenic signaling rewiring という新たな耐性パラダイムを提示している。
② 新規性：本研究で初めて、KRAS G12C 阻害薬による持続的圧力が dual KRAS G12C/EML4-ALK 細胞のシグナルを ALK 単剤感受性へと再配線することが in vitro・in vivo の両面で示された。また、EML4-ALK が野生型 KRAS ではなく野生型 H/N RAS を活性化して KRAS G12C 阻害をバイパスするという機序は新規であり、これにより RAS(ON) 多選択的阻害薬（RMC-7977）が pan-KRAS(OFF) 阻害薬（BI-2865）に比べて耐性状況で優れた活性を維持することを初めて機能的に実証した (Johnson et al. CancerDiscov 2022)。
③ 臨床応用：本研究の知見は KRAS G12C 阻害剤耐性患者に対する戦略的な治療シークエンスの根拠を提供する。臨床応用として考えられる選択肢は (a) KRAS G12C 阻害剤耐性時に次世代シーケンスで ALK 融合を確認したうえで ALK/KRAS G12C 阻害薬の合剤投与、(b) 持続的 KRAS G12C 阻害後は single-agent ALK 阻害薬への逐次移行、(c) RMC-7977 + alectinib 合剤という pan-RAS 戦略の 3 段階であり、特に RMC-7977 は全ての治療段階にわたって活性を維持することから「backbone」的役割が期待される。EGFR/MET 共標的（INSIGHT 2 試験：tepotinib + osimertinib で ORR 50% vs. tepotinib 単剤 8%）で示された「primary driver への持続的抑制 + emergent alteration 標的」という concept とも一致する。
④ 残された課題：本研究は免疫不全マウスモデルを使用しており、免疫細胞が治療応答に与える影響は未解明である。また、GCC2-ALK など EML4-ALK 以外の ALK 融合パートナー変異や、RET 融合以外の TK 融合への外挿性、ならびに RMC-7977 の臨床試験データの成熟が今後の検討課題である。さらに、oncogenic signaling の過剰活性化を意図的に誘発する「drug holiday」戦略の臨床的実現可能性（腫瘍 fitness の毒性を活用した治療）や、ctDNA による minimal residual disease 監視との統合も今後の方向性として残されている。
方法
本研究は前臨床研究と 2 症例の臨床解析から構成される。臨床コホート: SPARK 試験（NCT05272423）に登録された KRAS G12C 変異固形腫瘍患者からの液性生検（FoundationOne CDX による血漿標的エクソームシーケンス）と組織 DNA シーケンスを使用した。細胞株: H23・H358・H2122・H1373・H3122（ヒト肺腺癌、ATCC 購入、短タンデム反復 (STR) プロファイル認証、mycoplasma 定期確認）および KP（KRAS G12D/p53-/- マウス肺腺癌、C57BL/6 syngeneic、Tyler Jacks 研究室提供）を使用した。CRISPR/Cas9 編集: FACTS 法（functionally active chromosomal translocation sequencing）により EML4 イントロン 6・ALK イントロン 19 に DSB を導入し EML4-ALK V3（E6;A20）、CCDC6-RET（E1;E12）各 fusion を生成した。sgRNA は CRISPick で設計し Sanger シーケンスで確認。薬物感受性試験: 1×10³ 細胞/96 well, 10 点 dose titration（1 nM-10 μM）、72 時間後 CellTiter-Glo 2.0 測定、IC50 は 4-parameter logistic curve fitting（GraphPad Prism 10）で算出。相乗性は ZIP 法（SynergyFinder 3.0）および Combenefit（Loewe 加算モデル）で評価した。ウエスタンブロット: 細胞溶解に RIPA（radioimmunoprecipitation assay）バッファーを使用し、phospho-ALK（Thr1278）、pERK1/2、pMEK、pAkt（Ser473）、pSHP2（Tyr542）、BIM（C34C5）、β-actin 等（Cell Signaling/Proteintech）各抗体で検出した。全実験は少なくとも 3 回独立して実施した（triplicate）。RAS-GTP pull-down: Active Ras Detection Kit（Cell Signaling Cat#8821）を使用し、Raf の RAS 結合ドメイン（RBD）とグルタチオン S-トランスフェラーゼ（GST）の融合タンパク質 Raf-RBD-GST で活性型 RAS を捕捉、500 μg タンパク質を使用した。in vivo 実験: NSG 雌マウス（6 週齢）に 5×10⁶ 細胞を皮下注入し、腫瘍が 50-100 mm³ 到達後 n=5 以上の群に無作為割り付け、adagrasib（10% Captisol/50 mM クエン酸 pH5.0 懸濁）および alectinib/RMC-7977（各 10 mg/kg/日、経口投与）で最大 90 日処置した。腫瘍体積はキャリパーで隔日測定し、ANOVA + Tukey 多重比較検定（最終時点）で解析した（p<0.05 を有意とした）。組織学的解析は H&E 染色、Ki67 免疫染色（abcam ab16667）を実施した。統計: 2 群比較は Student 両側 t 検定、多群は ANOVA（GraphPad Prism）を使用した。サンプルサイズの事前設定は行っていない（動物実験）。