- 著者: John A. Grout, Philemon Sirven, Andrew M. Leader, Shrisha Maskey, Eglantine Hector, Isabelle Puisieux, Fiona Steffan, Evan Cheng, Navpreet Tung, Mathieu Maurin, Romain Vaineau, Lea Karpf, Martin Plaud, Anne-Laure Begue, Koushik Ganesh, Jérémy Mesple, Maria Casanova-Acebes, Alexandra Tabachnikova, Shilpa Keerthivasan, Alona Lansky, Jessica Le Berichel, Laura Walker, Adeeb H. Rahman, Sacha Gnjatic, Nicolas Girard, Marine Lefevre, Diane Damotte, Julien Adam, Jerome C. Martin, Andrea Wolf, Raja M. Flores, Mary Beth Beasley, Rachana Pradhan, Soren Muller, Thomas U. Marron, Shannon J. Turley, Miriam Merad, Ephraim Kenigsberg, Hélène Salmon
- Corresponding author: Hélène Salmon (Institut Curie, INSERM U932, Paris, France); Ephraim Kenigsberg (Icahn School of Medicine at Mount Sinai, New York, NY, USA)
- 雑誌: Cancer Discovery
- 発行年: 2022
- Epub日: 2022-09-06
- Article種別: Original Article
- PMID: 36027053
背景
肺がんは世界のがん関連死亡原因の第 1 位であり、非小細胞肺がん (non-small cell lung carcinoma: NSCLC) がその大多数を占める。近年、免疫チェックポイント阻害薬 (immune checkpoint blockade: ICB) の導入により NSCLC 治療は大きく進歩したが、奏効する患者は一部に限られ、腫瘍微小環境 (tumor microenvironment: TME) における T 細胞局在制御の理解不足が大きな障壁となっている (Borghaei et al. NEnglJMed 2015)。腫瘍巣内の CD8+ T 細胞密度は ICB 応答の強力な予測因子であるが、多くの患者では T 細胞が腫瘍巣周囲のストロマに滞留し内部へ浸潤できない「T 細胞排除 (T-cell exclusion)」表現型が観察される。Mariathasan et al. Nature 2018 は、TGFβ (transforming growth factor beta) シグナルが T 細胞排除を誘導し抗 PD-L1 療法への抵抗性に寄与することを示した。またヒト NSCLC のリアルタイムイメージングにより、腫瘍・ストロマ境界部に存在する高密度かつ平行に配向したコラーゲン線維が T 細胞の物理的な浸潤障壁として機能することが示唆されていたが、その線維を産生する細胞の同一性と分子プログラムは不足していた。
がん関連線維芽細胞 (cancer-associated fibroblast: CAF) は腫瘍ストロマの主要な構成要素であり、細胞外マトリックス (extracellular matrix: ECM) 産生を通じて免疫細胞の空間的局在を調節しうる。二次リンパ器官では線維芽細胞がケモカインや ECM コンジットを形成してリンパ球動態を厳密に制御することが確立されているが、腫瘍ストロマにおける CAF サブセットごとの機能分担と T 細胞排除との直接的な関連性は手薄であった。Lambrechts et al. NatMed 2018 を含む複数の NSCLC scRNA-seq 研究が CAF の転写多様性を記述したものの、各 CAF サブセットの空間配置と T 細胞排除を直接結びつける証拠はgap in knowledge として残されており、また膵がんモデルで確立された iCAF (inflammatory CAF) / myCAF (myofibroblastic CAF) の二分類がヒト肺がんに適用できるかも不明であった。
目的
scRNA-seq による網羅的な転写プロファイリングと多重 IHC (immunohistochemistry) による高解像度空間マッピングを統合し、ヒト NSCLC に存在する CAF サブセットの多様性を無仮説的に同定する。特に T 細胞排除を直接駆動する CAF サブセットと、各サブセットが産生する ECM 分子プログラムの詳細を明らかにすることで、ICB 応答不良の T cell-excluded 腫瘍に対する新規治療標的を提示する。
結果
4 つの主要 CAF サブセットの同定と組織内空間配置: ヒト NSCLC 組織の scRNA-seq 解析 (腫瘍 n=15、隣接組織 n=12、31,402 ストロマ細胞) により、3 大系統 (線維芽細胞、内皮細胞、血管周囲細胞) を同定した後、線維芽細胞画分から腫瘍特異的な 4 つの CAF サブセットを同定した (Fig 1)。(1) ADH1B+ CAF: アルコール脱水素酵素 ADH1B を高発現する比較的低活性化のサブセットで、ストロマ全域に広く分布し T 細胞浸潤を妨げない。(2) FAP+ CAF: FAP、POSTN、LRRC15、GREM1 等の古典的 CAF マーカーを高発現し、ストロマ全域に分布するがαSMA 発現は低い。(3) FAP+αSMA+ CAF: FAP+ CAF のサブセットで αSMA を高発現し、収縮性・ECM 遺伝子を強く発現してストロマ内でパッチ状または腫瘍巣周囲に多層の障壁を形成する。(4) MYH11+αSMA+ CAF: ミオシン重鎖 11 (MYH11) と αSMA を共発現し、FAP- ADH1B- CD34int の独特な発現パターンを示すサブセットで、腫瘍巣の直境界部を隙間なく単一細胞層 (single cell layer) で被覆するという際立った空間配置を示す。CyTOF によってこれら主要サブセットのタンパク質発現パターンが確認された (Fig 2)。ADH1B+ CAF の一部は CCL19、CCL21、VCAM1 (vascular cell adhesion molecule 1) を高発現し、IHC にて三次リンパ様構造 (tertiary lymphoid structure: TLS) の T 細胞ゾーンに特異的に局在することが示され、MHCII (MHC class II) 遺伝子も発現していた (apCAF (antigen-presenting CAF) としての機能が示唆された)。
腫瘍ステージおよび組織型による CAF 組成の二分法的変化: CAF 組成は臨床ステージおよび組織型と密接に相関していた (Fig 3)。IHC コホート (n=35) の定量解析では、NSCLC 腫瘍ストロマが ADH1B+ と FAP+ のいずれかで優勢であるという排他的な二分法的パターンを示し (hypergeometric 検定 p=0.008)、ADH1B+ CAF 優勢群の 9/18 例に MYH11+αSMA+ CAF が共存したのに対し、FAP+ CAF 優勢群では MYH11+αSMA+ CAF の腫瘍境界単層被覆パターンは認められなかった。TCGA-LUAD (n=509) のバルク RNA-seq 解析では、ADH1B+ CAF シグネチャーと FAP+ CAF シグネチャーが有意に逆相関し (Pearson R=-0.12、p=0.006)、ADH1B+ CAF は早期ステージ (Stage 1) および乳頭状/腺管状 (papillary/acinar) 亜型の LUAD と正相関を、FAP+ CAF は進行ステージ (Stage 2+)、充実性 (solid) 亜型の LUAD、および肺扁平上皮がん (lung squamous cell carcinoma: LUSC) と正相関を示した。浸潤辺縁部から腫瘍中心部にかけて ADH1B+ から FAP+ への発現勾配が空間的に観察され、微小環境からの刺激による CAF 活性化トラジェクトリーが示唆された。これら CAF サブタイプの二分化パターンは 4 つの外部 NSCLC scRNA-seq データセットでも再現確認された。
MYH11+αSMA+ CAF による早期腫瘍での T 細胞排除: 早期 (Stage 1) 腫瘍において、MYH11+αSMA+ CAF の腫瘍境界単層被覆の有無により T 細胞の腫瘍内浸潤が明確に異なることが示された (Fig 5)。MYH11+αSMA+ CAF が存在する患者では非存在患者と比較して、腫瘍内 CD3+ T 細胞密度 (p=0.03) および CD8+ T 細胞密度 (p=0.01) が有意に低く、腫瘍/ストロマ比も CD3+ (p=0.04)、CD8+ (p=0.04) ともに有意に低下していた。定量的タイル解析では MYH11+αSMA+ CAF スコア (腫瘍境界 <10 μm の細胞密度を遠位 20-30 μm の密度で補正したスコア) が腫瘍内 CD3+ 密度と有意な負の相関 (Pearson) を示した。MYH11+αSMA+ CAF は LUAD の腺管状/乳頭状亜型に特異的で、充実性 LUAD や LUSC では腫瘍境界単層被覆パターンは認められなかった。ヒトタンパク質アトラス (Human Protein Atlas) の IHC データでは膵がん・乳がんでも同様の腫瘍境界 MYH11+ 単層が観察され、他がん種での普遍性が示唆された。scRNA-seq データでは MYH11+αSMA+ CAF が TGFB1、WNT5A、WNT11 等の免疫抑制シグナル遺伝子を高発現しており、TGFβ/WNT-β-カテニン経路を介した T 細胞機能抑制への寄与も示唆された。
FAP+αSMA+ CAF による進行腫瘍での T 細胞排除と固有の ECM プログラム: FAP+ CAF 優勢腫瘍において、αSMA+ CAF の空間的集積と T 細胞排除の定量的相関を解析した (Fig 6)。ストロマの αSMA 被覆率と CD3+ T 細胞密度の間に強い負の相関 (Pearson R=-0.48、P<1e-10) が認められ、腫瘍巣を多層に取り囲む FAP+αSMA+ CAF が存在する領域は T 細胞がほぼ欠如していた。Masson’s trichrome 染色では、MYH11+αSMA+ および FAP+αSMA+ CAF を含む腫瘍のいずれにおいても腫瘍境界部に高密度の線維沈着が認められた。scRNA-seq の ECM 遺伝子解析では、MYH11+αSMA+ CAF が基底膜型コラーゲン (COL4A1、COL4A2)、ラミニン (LAMA5、LAMB2)、ニドジェン (NID1、NID2) を特異的に高発現する基底膜型プログラムを示す一方、FAP+αSMA+ CAF は線維性コラーゲン XI (COL11A1)、XII (COL12A1)、ペリオスチン (POSTN)、ビグリカン (BGN) を高発現する間質線維型プログラムを示した。タイル別定量 (n=35) では αSMA 被覆率が Collagen XI 沈着量 (Spearman R=0.61、n=35、p<0.001) および Collagen XII 沈着量 (Spearman R=0.72、n=35、p<0.001) と強く相関したのに対し、Collagen IV 沈着量との相関は認められなかった (Spearman R=0.22、n=35、p=0.12)。FAP+αSMA+ CAF 存在領域ではコラーゲン線維が腫瘍・ストロマ境界線と平行に高度に整列配向していた。先行研究 (Salmon et al. JCI 2012) で T 細胞ライブイメージングを行った NSCLC 検体 3 例の FFPE 切片を再染色したところ、T 細胞排除が観察された腫瘍境界部に多層の FAP+αSMA+ CAF が確認され、同研究でコラーゲナーゼ処理により T 細胞と腫瘍細胞の接触が増加したことと合わせて、FAP+αSMA+ CAF が形成する密な ECM 障壁が T 細胞排除の直接的原因であることが実験的に裏付けられた。
FAP+ CAF と免疫細胞組成、および ADH1B+ vs FAP+ CAF の T 細胞局在への非相関: FAP+ CAF は T 細胞の空間分布と相関しないにもかかわらず、免疫細胞組成とは強く相関していた (Fig 4)。同コホートの免疫細胞 scRNA-seq プロファイリング (Leader et al. CancerCell 2021) との統合解析により、FAP+ CAF 優勢腫瘍が SPP1+ 単球由来マクロファージ、IgG+ 形質細胞、PD1+ T 細胞からなる炎症活性化免疫モジュール「LCAM (Lung Cancer Activation Module)」と有意に相関することが示された (IHC コホート: Pearson R=0.62、p=0.01; TCGA: Pearson R=0.66、P<1e-10)。一方、ADH1B+ CAF 優勢群と FAP+ CAF 優勢群で腫瘍/ストロマの CD3+、CD8+、FOXP3+ T 細胞比率に有意差はなく (t-test、n.s.)、ADH1B+ および FAP+ CAF 全体としての T 細胞の空間分布への影響は認められなかった。
考察/結論
本研究は、ヒト NSCLC における CAF の多様性を scRNA-seq と多重 IHC の統合により包括的に解析し、T 細胞排除を駆動する 2 つの独立した αSMA+ CAF サブセットと各々に固有の ECM 分子プログラムを明らかにした。
先行研究との相違: 膵がんおよび乳がんの先行研究では、CAF は主に iCAF (低活性化・分泌型) と myCAF (高活性化・収縮型) に二分類されてきた。本研究はヒト肺がんにおいて myCAF 表現型が転写プロファイル・空間配置・ECM プログラムの明確に異なる 3 サブセット (FAP+ CAF、FAP+αSMA+ CAF、MYH11+αSMA+ CAF) に細分化されることを示しており、従来の単純な myCAF/iCAF 二分法と対照的である。またこれまでの研究では FAP+ CAF 全体が T 細胞排除の主要ドライバーと想定されてきたが、本研究は FAP+ CAF 全体としては T 細胞分布と無相関であり、αSMA を共発現する特定のサブセット (FAP+αSMA+ CAF) のみが T 細胞排除と相関することを示した。これは FAP 標的抗体 (sibrotuzumab 等) を用いた過去の臨床試験が臨床ベネフィットを示さなかった理由を細胞サブセットレベルで説明しうる既報と異なる知見である。
新規性: 腫瘍巣を単一細胞層で被覆し IV 型コラーゲン主体の基底膜様障壁を形成する MYH11+αSMA+ CAF サブセットを本研究で初めてヒト肺がんで記述した点が最大の新規な発見である。このサブセットは早期 LUAD の腺管状/乳頭状亜型に特異的に出現し、単一細胞層のみで T 細胞排除を誘導するというこれまで報告されていない独自のメカニズムを持つ。さらに FAP+αSMA+ CAF が XI/XII 型コラーゲン配向線維障壁を産生し T 細胞排除の原因であることをコラーゲナーゼ実験の再解析により直接実証した点もnovelであり、腫瘍ストロマにおける ECM 物理障壁と T 細胞排除の因果関係を新規に確立した。
臨床的意義: 本知見は T cell-excluded 腫瘍に対する新規治療アプローチの臨床応用に直結する。早期 LUAD では MYH11+αSMA+ CAF が IV 型コラーゲン障壁を介した T 細胞排除を駆動するため、MYH11 発現調節や IV 型コラーゲン特異的介入が有効な可能性がある。進行がんでは FAP+αSMA+ CAF が XI/XII 型コラーゲン線維障壁を形成するため、このサブセット特異的な CAF 除去戦略や LOX (lysyl oxidase) 阻害等のコラーゲン架橋阻害が臨床現場での ICB 増強につながりうる。CAF サブタイプが NSCLC 組織型・ステージと相関することで、病理所見に基づいた CAF 型別の治療選択を可能にする臨床的有用性も高い。また FAP+αSMA+ CAF が LCAM (炎症活性化免疫表現型) と相関することから、LCAM スコアが FAP+αSMA+ CAF 標的療法の適応指標となりうる臨床的含意がある。
残された課題: 残された課題として、MYH11+αSMA+ CAF の細胞起源 (血管周囲細胞や平滑筋細胞からのトランス分化の有無) の in vivo 運命追跡実験による確認が必要である。ADH1B+ CAF から FAP+ CAF への活性化移行が示唆されるが、この遷移を誘導する物理的・分子的シグナルの同定も今後の研究として重要である。FAP+αSMA+ CAF の選択的除去が正常組織の筋線維芽細胞に与える毒性リスクの評価や、コラーゲンサブタイプ特異的な ECM 介入の in vivo 実証も今後の検討が必要なlimitationとして残されている。また MYH11+αSMA+ CAF の他がん種での普遍性 (膵がん・乳がんの Human Protein Atlas データに示唆) についても、大規模コホートでの更なる検討が求められる。
方法
研究デザインとコホート: ヒト NSCLC 外科切除検体を対象とした多施設トランスレーショナル研究。scRNA-seq コホートは NSCLC n=15 例の腫瘍組織および対応する隣接非がん部肺組織 n=12 例から構成された。独立した IHC 検証コホートとして別途 NSCLC FFPE (formalin-fixed paraffin-embedded) 検体 n=35 例を用いた。ヒト検体の使用は Mount Sinai Medical Center IRB (Institutional Review Board、プロトコル 10-00472、10-00135) および Institut Mutualiste Montsouris (EudraCT (European Union Drug Regulating Authorities Clinical Trials) 番号 2017-A03081-52) の倫理委員会承認のもとで実施した。
scRNA-seq: 酵素的消化後、フローサイトメトリーにより免疫細胞 (CD45+) および上皮・腫瘍細胞 (EpCAM (epithelial cell adhesion molecule)+) を除去し、CD29 (integrin beta-1) 陽性のストロマ画分 (CD45-EpCAM-CD29+) を精製分取した。10X Genomics Chromium プラットフォームで各検体 5,000 細胞をロードして scRNA-seq を実施し、品質管理 (UMI (unique molecular identifier)>800、ミトコンドリア遺伝子比率<25%) を通過した計 31,402 個のストロマ細胞データを取得した。バックグラウンドノイズをモデル化した unsupervised batch-aware クラスタリングアルゴリズムを適用し、28 クラスターを同定した。シーケンスデータは NCBI GEO (Gene Expression Omnibus、accession GSE183219) に登録。
多重 IHC: MICSSS (Multiplexed Immunohistochemical Consecutive Staining on Single Slide) プロトコルに準拠し、同一の FFPE 切片に対して MYH11、αSMA (alpha smooth muscle actin)、FAP (fibroblast activation protein)、ADH1B (alcohol dehydrogenase 1B)、CD10 (neprilysin)、CCL19 (C-C motif chemokine ligand 19)、コラーゲン IV、コラーゲン XI、コラーゲン XII を含む最大 12 種類のマーカーを連続染色・脱色・再染色した。デジタル病理解析ソフト QuPath Bankhead et al. SciRep 2017 を用いて 500×500 μm タイルに分割し、CAF 被覆率および T 細胞密度を自動定量した。
補完的解析: 質量分析サイトメトリー (mass cytometry by time of flight: CyTOF) によるタンパク質レベルの検証、TCGA (The Cancer Genome Atlas) 肺腺がん (lung adenocarcinoma: LUAD) バルク RNA-seq (n=509) での CAF シグネチャー解析、4 つの公開 NSCLC scRNA-seq データセット (Lambrechts, Kim, Laughney, Wu ら) による外部検証を実施した。Masson’s trichrome 染色および第二高調波発生 (second harmonic generation: SHG) 顕微鏡でコラーゲン線維密度・配向を定量した。
統計解析: 群間比較に Student t-test および Mann-Whitney U test を、相関解析に Pearson correlation および Spearman correlation を、過剰代表性検定に hypergeometric test を、生存解析に log-rank 検定および Cox 比例ハザードモデルを用いた。