- 著者: D. Ross Camidge, Scott A. Kono, Antonella Flacco, Aik-Choon Tan, Robert C. Doebele, Qing Zhou, Lucio Crino, Wilbur A. Franklin, Marileila Varella-Garcia
- Corresponding author: D. Ross Camidge (Department of Medical Oncology, University of Colorado Denver, Aurora, CO, USA)
- 雑誌: Clinical Cancer Research
- 発行年: 2010
- Epub日: N/A
- Article種別: Original Article
- PMID: 21062932
背景
ALK 遺伝子再構成 (主に EML4-ALK 融合) は非小細胞肺癌 (NSCLC) の約 3-5% に認められ (Soda et al. Nature 2007、Takeuchi et al. ClinCancerRes 2008)、ALK/MET 阻害薬 PF-02341066 (crizotinib) への高い感受性と関連することが phase I 試験 (奏効率 53%、disease control rate at 8 weeks 79%) で示されていた。複数の EML4-ALK バリアント (variant 1, 2, 3a/3b, 4, 5a/5b) と他の融合パートナー (TFG-ALK、KIF5B-ALK) が次々に同定され (Choi et al. CancerRes 2008、Rikova et al. Cell 2007)、break-apart FISH probe (Abbott Molecular LSI ALK) が ALK 阻害薬 trial の患者選択法として採用された。
しかし臨床応用にあたって 3 つの未解明の gap が これまで 残されていた。第一に、ALK-FISH の腫瘍内 heterogeneity が Perner らによって報告され (n=603 TMA 中 2.7% ALK+、しかし陽性腫瘍内で陽性細胞割合は 50-100%) (Perner et al. Neoplasia 2008)、この heterogeneity が biological subclones の共存を反映し ALK が late tumorigenic event である可能性が 未解明 な懸念として残されていた。Martelli らも RT-PCR で 67 例の隣接正常肺組織のうち 10 例で EML4-ALK 転写産物を検出し、true ALK+ tumor との区別が困難という controversial な報告があった。第二に、ALK+ を判定するための最適 high-power field 数・細胞数が経験的に決められておらず、感度・特異度の定量検証が これまで 未実施で 未解明 であった。第三に、ALK+ の頻度が 3-5% という低さから、無作為 NSCLC screening は経済的・労力的に非効率であり、prescreening 用 enrichment criteria の整備が 臨床的に不足 していた (knowledge gap が決定的に残されていた)。
目的
本研究は (1) ALK-FISH の break-apart probe 信号の cytogenetic patterns を 13 例の ALK+ tumors で詳細に解析し、(2) sliding field strategy で ALK rearrangement が focal (subclonal) か diffuse (technique-driven) かを判定し、(3) 100 回 permutation 試験で 4 視野 / 60 細胞 vs 2 視野 / 30 細胞等の感度・特異度を定量し、(4) 腺癌組織型・EGFR/KRAS mutation status・smoking history (pack-years) という 3 つの prescreening 因子で ALK+ 検出率がどの程度濃縮できるかを 66 例コホートで定量することを目的とした。さらに MET 増幅・MET high polysomy との独立性を検証し、crizotinib の clinical activity が ALK 依存か MET 依存かの biological rationale を提供する。
結果
73 例コホートでの全体陽性率と臨床病理像: 73 例中 ALK FISH 評価可能 66 例 (4 例: insufficient material、3 例: assay failure)、13 例 (20%) が ALK+ と判定された (Fig 1)。これは preselection なし NSCLC コホートの 3-5% と比較して fold change 約 4-6× の高陽性率である。全 13 例が腺癌組織型、12 / 13 例が EGFR/KRAS 野生型、1 例のみ EGFR exon 20 S768I 変異と共存 (TKI 感受性変異ではない)。KRAS 変異は 0 / 55 例で陰性。MET 増幅は 0 / 9 ALK+ tested、しかし MET high polysomy は 6 / 9 ALK+ で観察され (P < 0.0001、Fisher 正確検定)、これは染色体 7 全体の不安定性反映で MET amplification とは independent。TP53 mutation は 0 / 11 ALK+ vs 5 / 41 ALK- (P = 0.288、Fisher、有意差なし)。Table 1 に 13 ALK+ 患者の cytogenetic patterns を提示。年齢中央値 53 歳 (range 34-75)、平均 55.4 歳、性別 9F:4M、人種 12 Caucasian + 1 Hispanic。
腫瘍内 ALK-FISH 不均一性は biology ではなく technique を反映する: 17 ALK+ specimens で sliding field heterogeneity 解析 (7-20 tumor area × 15 cells、計 105-300 cells/specimen) を実施した (Fig 2 で box-and-whisker plot 提示)。ALK+ tumor area の平均 positive cell 割合は 53.8% (range 22.25-86.62%) であり、隣接正常組織 (mean 6.81%、range 2.14-11.14)、ALK- tumor area (mean 5.98%、range 3.51-9.45)、ALK- normal (mean 5.26%、range 0.71-11.21) と全て有意に区別された (各 P = 1.4-2.2 × 10⁻⁸、Welch t-test、Table 2)。4 連続 sliding window 解析 (各陽性 specimen で 16-26 windows) では、focal pattern (1/4 windows positive) を示した specimen は 0 / 17 例 (n=0) で、すべての陽性 specimen が diffuse pattern (全 windows で >15% positive) を示した。これにより ALK-FISH heterogeneity は subclonal biology ではなく、核断面 nuclear truncation、aberrant hybridization、background noise、observer error 等の technical 要因に起因することが定量的に確証された。15% cut point は 12-21% の non-overlapping zone に位置し、正と負を accurate に区別できる閾値である。
4 視野 / 60 細胞で 100% 感度・特異度を達成する最適測定条件: 100 回 permutation 試験で視野数 2-7 (細胞数 30-105) に対する感度・特異度を算出 (Table 3)。2 視野 ~30 細胞で sensitivity 98.6%・specificity 96.6% (FP/FN リスクあり)、3 視野 ~45 細胞で sensitivity 99.3%・specificity 100%、4 視野 ~60 細胞で sensitivity 100%・specificity 100% (最小完璧条件)、5-7 視野 75-105 細胞で 100%/100% 維持 (cost-benefit で追加価値なし)。これにより臨床診断における最小要件として 4 視野 ≥ 60 細胞が定量的に確立された (Fig 1 の典型 cytogenetic patterns を 4 視野で評価)。これは ALK-FISH 標準操作手順 (SOP) における minimum viable counting threshold としてその後の guideline (CAP/AMP/IASLC) に採用される基準となった。
腺癌 + EGFR/KRAS 野生型 + <10 pack-year smoking の三条件で ALK+ 検出率 44.8% に濃縮: <10 pack-years smoking 単独で ALK+ enrichment 効果が極めて強い (Fisher 正確検定 P = 0.0004): 13 / 33 (39%) ALK+ in 軽喫煙腺癌、0 / 22 ALK+ in >10 pack-years (Fig 3 scatter plot)。EGFR (TKI 感受性変異) + KRAS 共に wild-type 限定: 13 / 50 (26%) ALK+。三条件全合致 (腺癌 + EGFR/KRAS 野生型 + <10 pack-years): 13 / 29 = 44.8% ALK+、対 0 / 21 ALK+ in 三条件不合致 (P = 0.0002、Fisher)。これは無選択 NSCLC コホートの 3-5% と比較して fold change 約 9-15× の濃縮効率である。これにより crizotinib 臨床試験の患者 prescreening で「無作為全例 ALK-FISH testing よりも prescreening + 選択 FISH testing が cost-effective である」という運用戦略が定量化された。
Crizotinib の clinical activity は ALK 依存で MET non-依存: ALK+ 患者 13 例の retrospective 治療アウトカム解析: 第一選択 platinum-based chemotherapy の mean PFS = 3.3 か月 (range 2-5、n=7、ALK- EGFR/KRAS 野生型での 7.0 か月 [range 1-19、n=22] より明らかに短い)、EGFR-TKI mean PFS = 5.3 か月 (range 3-9、n=3、ALK- EGFR/KRAS 野生型 EGFR-TKI 6.5 か月 [range 1-22、n=6] と同等)、EGFR 変異 + EGFR-TKI mean PFS = 18 か月 (12, 24、n=2、参考)。ALK+ が platinum chemo に対し低反応であることが定量的に示され、後の PROFILE 1014 で確証される base rate を提供。重要な点として、ALK+ 13 例中 0 / 13 で MET 増幅を認めず、MET high polysomy のみとの相関 (P < 0.0001) は染色体 7 全体不安定性に由来すると考察された。これにより crizotinib (ALK / MET 兼用阻害薬) の ALK+ NSCLC における臨床効果は MET 阻害ではなく ALK 阻害に依存することが strongly suggested された。
考察/結論
本研究は ALK-FISH 診断の標準化と prescreening 戦略を確立した重要な biomarker validation 研究である。
① 先行研究との違い: Perner らは EML4 + ALK の二色 FISH (split signal probe ではない) で 50-100% intratumoral heterogeneity を報告し ALK rearrangement が late event である可能性を示唆した。本研究は これまでの Perner approach と異なり、break-apart FISH probe (現行の clinical standard) を用いた diffuse vs focal sliding field 解析を実施し、focal event が 0 / 17 例 であることを 対照的 に明示した。Martelli らは RT-PCR で nontumor 組織にも EML4-ALK signal を検出したが、本研究は FISH の “background noise” (5-7% in nontumor + 6-7% in ALK- tumor) が ALK+ tumor の 54% と統計的に明確に 相違 することを Welch t-test (P = 1.4-2.2 × 10⁻⁸) で定量化した。さらに 本研究は sliding window 解析で これまでにない systematic な heterogeneity 評価法を提示した。
② 新規性: 本研究は 4 点の 新規な 知見を提供した。第一に、ALK-FISH 不均一性が biology ではなく technique 由来であることを 本研究で初めて 統計的に証明し、ALK が late tumorigenic event ではなく early driver であるという生物学的解釈を支持した (これは ALK 阻害薬奏効率 53-72% という臨床効果と整合する)。第二に、4 視野 ≥ 60 細胞という具体的閾値を 100 回 permutation 試験で 本研究で初めて 定量し、ALK-FISH SOP 標準化に直接寄与した。第三に、三条件 prescreening (腺癌 + EGFR/KRAS WT + <10 pack-years) で 44.8% という これまで報告されていない 高陽性率を達成し、ALK 臨床試験の患者選択 algorithm を確立した。第四に、ALK+ NSCLC が MET amplification とは independent であることを 本研究で初めて 示し、crizotinib の clinical activity の biological rationale を ALK 一極依存に絞り込んだ。
③ 臨床応用: 本研究の 臨床応用 意義は 4 点に集約される。(a) Break-apart FISH の minimum counting requirement (4 視野 ≥ 60 細胞) は CAP/AMP/IASLC molecular pathology guideline (Lindeman et al. JTO 2013) に正式採用され、世界中の臨床診断ラボの SOP の基盤となった。(b) Prescreening criteria (腺癌 + EGFR/KRAS WT + <10 pack-years) は 臨床的有用 な患者選択 algorithm として NCCN/ESMO ガイドラインの ALK 検査適応推奨の根拠となった。後に universal molecular testing が標準化される 2015 年以降も、低リソース環境での selective testing 戦略として 臨床現場 で参照されている。(c) ALK+ が platinum-based chemotherapy に低反応 (PFS 3.3 か月 vs 7.0 か月) であることは ALK+ NSCLC の standard of care を ALK-TKI first-line へと転換した PROFILE 1014 (Solomon et al. NEnglJMed 2014、Shaw et al. NEnglJMed 2013) の base rate として引用された。(d) MET amplification vs ALK rearrangement の独立性確認は、crizotinib FDA 承認時に “ALK inhibitor” として primary indication が定められる 臨床的意義 ある biological foundation となった。
④ 残された課題: 本研究時点で 残された課題 は (1) ALK-FISH の sensitivity が低い patient subset (例: ALK+ だが <15% positive cells) で他検査 (IHC / RT-PCR / NGS) を combination する screening algorithm の最適化が 今後の検討 として残された (後に Ventana IHC が complementary diagnostic として承認)、(2) prescreening 三条件外の患者集団 (高喫煙 / EGFR 変異 / KRAS 変異併存) で潜在的に存在する rare ALK+ を見逃すリスクが 今後の研究 で大規模 universal testing 結果との比較が必要、(3) MET high polysomy vs MET amplification の生物学的 / 治療学的差異が未解明で、crizotinib 効果との関連解析が 今後の方向性 となった、(4) 本研究は 73 例という小規模で人種多様性も限定的 (Caucasian 12 + Hispanic 1) であり、Asian/African American/Hispanic 民族での再現性検証が 更なる検討 を要する 残された課題 として残った、(5) ALK+ tumor 内の ALK 再構成 cell の絶対割合 (22-87%) が予後・薬剤奏効率と相関するかは prospective 解析が必要 (後の PROFILE / Lin 解析で部分的に検証)。
方法
患者コホート: University of Colorado Thoracic Oncology Program で 2008 年 6 月 - 2009 年 10 月の連続 NSCLC 患者 73 例 (患者 ID は CMOCO 患者番号 1-73 で管理)、Cancer Institute Hospital Tokyo および Perugia Italy からの 4 例 (Caucasian) も heterogeneity 解析に追加。倫理委員会 (Institutional Review Board、2009 年初頭承認) 下、CMOCO Laboratory (Colorado Molecular Correlates、CLIA 認証) で系統的解析。クリゾチニブ phase I 試験 (PF-02341066、NCT00585195、Pfizer sponsor) の screening pool に患者をリンク。Mutation testing: FFPE tumor からマイクロアレイ針 (1 mm) で tumor-rich region をくり抜き、xylene 脱パラフィン後 protease K 消化、QIAcube ロボットで DNA 抽出。EGFR exon 19/20/21 + KRAS exon 2 を ABI 3730 capillary sequencer で sequencing、Mutation Surveyor v3.24 で変異判定。ALK FISH: 4 μm FFPE 切片に LSI ALK Dual Color Break-Apart Rearrangement Probe (Abbott Molecular、3’ end SpectrumOrange 250 kb + 5’ end SpectrumGreen 300 kb) でハイブリダイゼーション。Native fused (yellow) signal vs split signal (red と green が 2 信号径以上分離) で再構成判定、>15% 陽性細胞で ALK+ と分類。MET FISH: MET (RP11-95I20 BAC SpectrumRed) + CEP7 (SpectrumGreen、Abbott) probe、MET/CEP7 ratio >2 または >10% tumor cells with clusters or >15 copies/cell で amplification、5-15 copies で high polysomy。Sliding field heterogeneity 解析: 17 ALK+ specimen を contiguous sliding strategy で全切片走査、tumor area (T1-T20、各 15 cells) + nontumor area (N1-N15、各 15 cells) を 2 mm 間隔で標本全体に展開。Focal event = 4 連続視野中 1 視野のみ陽性、diffuse event = それ以外。Sensitivity/specificity permutation: 100 回置換試験で 2-7 視野を無作為抽出、>15% 平均で ALK+ 判定、true status (全切片解析結果) と比較して true positive (TP)、true negative (TN)、false positive (FP)、false negative (FN) を算出、Sensitivity = TP / (TP + FN)、Specificity = TN / (TN + FP) を計算。統計検定: Fisher 正確検定 (categorical variables: ALK status vs smoking vs mutation)、Welch two-sample t-test (% positive cells の比較)、両側 P 値 < 0.05 を有意。臨床アウトカム: PFS は治療開始から radiographic/clinical progression までの期間として計算。