- 著者: Li D, Ambrogio L, Shimamura T, Kubo S, Takahashi M, Chirieac LR, Padera RF, Shapiro GI, Baum A, Himmelsbach F, Rettig WJ, Meyerson M, Solca F, Greulich H, Wong K-K
- Corresponding author: Flavio Solca (Boehringer Ingelheim Austria, Vienna); Kwok-Kin Wong (Dana-Farber Cancer Institute / Harvard Medical School, Boston)
- 雑誌: Oncogene
- 発行年: 2008
- Epub日: 2008-04-14
- Article種別: Original Article (Preclinical / Drug discovery)
- PMID: 18408761
背景
非小細胞肺癌 (NSCLC: non-small cell lung cancer) のEGFR (epidermal growth factor receptor) キナーゼドメイン活性化変異 (exon 19 del や L858R) は第一世代可逆的 ATP-competitive EGFR チロシンキナーゼ阻害薬 (gefitinib・erlotinib) への高感受性を付与するが、ほぼ全例で数ヵ月内に獲得耐性が出現する (Lynch et al. NEnglJMed 2004; Paez et al. Science 2004)。獲得耐性の約半数は exon 20 内の T790M ゲートキーパー変異 (Kobayashi et al. NEnglJMed 2005) で、enzymatic activity と transforming activity が単独でも増強し、primary resistance を司る exon 20 insertion (Greulich et al. PLoSMed 2005) や glioblastoma 様 extracellular point mutation (R108K) も第一世代に対して partially-to-completely resistant であった。Cys-targeted covalent irreversible inhibitor が in vitro でこれら耐性変異に有効であることが報告されていた (Kwak et al. ProcNatlAcadSciUSA 2005) が、in vivo efficacy・kinome selectivity・safety profileの3点で臨床応用可能な化合物は未確立であり、特に T790M 駆動 transgenic murine lung cancer model 等の disease-relevant モデルで先行 irreversible inhibitor HKI-272 が mixed result に留まる課題が残されていた。何が足りなかったかというと、(a) 第一世代 EGFR-TKI 耐性 (T790M + exon 20 insertion 両方をカバー)、(b) HER2 (ERBB2) 変異/過剰発現にも有効、(c) wild-type kinome に対する高い selectivity、(d) in vivo で xenograft + transgenic disease model の両方で抗腫瘍効果、を同時に満たす irreversible dual EGFR/HER2 inhibitor の preclinical 証明が不足していた。
目的
BIBW2992 (Boehringer Ingelheim 開発のanilino-quinazoline 系 covalent irreversible dual EGFR/HER2 inhibitor、後の afatinib) について、(1) 細胞外無細胞系酵素活性測定で wild-type/L858R/L858R+T790M EGFR・HER2 ・他キナーゼ (52種) への IC50 を gefitinib・lapatinib・canertinib と比較、(2) NIH-3T3 ectopic EGFR mutant expression + soft agar anchorage-independent growth assay で oncogenic transformation 抑制を評価、(3) IL-3 dependent Ba/F3 cells に EGFR 変異体を導入して growth factor-independent 増殖モデルで cytotoxicity 比較、(4) NSCLC cell lines (H1666/H3255/NCI-H1975/HCC827/NCI-H1781/A549) で MTS assay と anchorage-independent IC50 を測定、(5) A431・NCI-N87・H1975 subcutaneous xenograft で in vivo 抗腫瘍効果と pharmacodynamic biomarker (pEGFR/pAKT) を評価、(6) Tet-op-L858R/T790M EGFR/CCSP-rtTA bitransgenic mouse model で MRI ベースの肺腫瘍縮小と rapamycin (mTOR inhibitor) 併用効果を検証する。
結果
BIBW2992 は無細胞 in vitro kinase assay で L858R/T790M に対し gefitinib の約100倍活性を示す： 精製 EGFR/HER2 kinase domain への IC50 値 (Table 1) は BIBW2992 で EGFR wild-type 0.5 nM・L858R 0.4 nM・L858R+T790M 10 nM・HER2 14 nM であり、gefitinib (L858R/T790M IC50 1013 nM) の約100倍 (100-fold) の活性を示した (BIBW2992 vs gefitinib、L858R+T790M 比較で 1013/10 ≈ 101倍)。Lapatinib (L858R/T790M >4000 nM) や canertinib (26 nM) と比較しても BIBW2992 は最も強力であった。他 52 種 protein kinase panel (β-InsRK >100,000 nM・HGFR 13,000 nM・c-SRC >4,000 nM・VEGFR-2 >100,000 nM) では selectivity が極めて高く、最も感受性が高かった off-target である lyn でも IC50 736 nM と十分な margin を維持していた (Supplementary Table 1A/1B)。これは第一世代可逆性 EGFR-TKI と同等の whole-kinome selectivity を維持しつつ T790M を含む covalent binding 標的に絞った設計の成功を示した。
Isogenic cell-based assay で全 erlotinib 耐性 EGFR mutant の oncogenic transformation を一桁から二桁 nM レベルで抑制する： NIH-3T3 ectopic expression model (Fig 1a) では BIBW2992 が L858R/T790M double mutant・exon 20 insertion D770_N771insNPG・glioblastoma extracellular R108K mutant・EGF-stimulated wild-type EGFR の全 isoform で anchorage-independent colony formation を有意に抑制し、各 mutant に対する効果濃度は erlotinib より 1-2桁 (10-100倍) 低かった (Fig 1a)。Anti-pEGFR Y1173 immunoblot (Fig 1b) では 100 nM BIBW2992 で全 mutant の autophosphorylation がほぼ消失したのに対し、erlotinib では 1,000-10,000 nM 必要だった。Ba/F3 IL-3-independent survival assay (Supplementary Table 3) でも L858R/T790M・exon 19 deletion ± T790M・variant III deletion・A289V・R108K extracellular mutations 全てに対して BIBW2992 が erlotinib より 少なくとも100倍強力で、T790M+ 単独および EGF-stimulated wild-type にも同等の活性を示した。これは BIBW2992 が T790M acquired resistance のみならず exon 20 insertion 由来の primary resistance も一括して overcome 可能であることを示し、これまで個別に対処されてきた多様な resistance mechanism を一つの分子で対処できる先行研究との対照的な利点となった (Kwak et al. ProcNatlAcadSciUSA 2005 の irreversible EKB-569 と比較しても broader spectrum)。
NSCLC cell line MTS assay で T790M+ NCI-H1975 を IC50 99 nM で抑制し、erlotinib 抵抗性株を sub-100 nM で生存抑制する： Anchorage-independent MTS assay (Fig 2b) では BIBW2992 IC50 が H1666 (wt EGFR) 60 nM vs erlotinib 110 nM、H3255 (L858R) 0.7 nM vs erlotinib 40 nM、NCI-H1975 (L858R/T790M) 99 nM vs erlotinib >4,000 nM (40倍以上の差)・gefitinib >4,000 nM・lapatinib >4,000 nM・canertinib 101 nM であった。subnanomolar IC50 (0.7 nM) は H3255 の gefitinib 感受性 L858R EGFR に対するもので、最高活性を発揮した。HCC827 (E746_A750del) と NCI-H1781 (HER2 776insV) でも 100 nM 未満の IC50 を達成、対照的に KRAS G12S 変異を持つ A549 cells には反応せず (両 wild-type EGFR/HER2)、これは BIBW2992 が EGFR/HER2 signaling 依存性腫瘍に limited mode-of-action を持ち on-target selectivity を維持していることを示した。HER3 phosphorylation も 100 nM BIBW2992 で heregulin-induced 状態でも抑制 (Supplementary Fig 1)、PI3K-AKT 上流の trans-phosphorylation も同時に遮断された。
Xenograft で T/C=2% (A431)・12% (H1975 L858R/T790M)・near-complete (NCI-N87 HER2+) の劇的腫瘍退縮を達成する： A431 epidermoid carcinoma xenograft (Fig 3a) で BIBW2992 20 mg/kg/day p.o. 25日治療により cumulative T/C (treated/control tumor volume) ratio 2% という劇的退縮を達成し、IHC で pEGFR と pAKT の著明な downregulation を確認 (Fig 3b)。動物は無耐性で control mice 同等の体重増加、Cmax と AUC0-24h は Phase I 臨床有効用量 (Eskens et al. BrJCancer 2008) と同等。最大耐用量で gefitinib (T/C=46% at 75 mg/kg/day) や lapatinib (T/C=32% at 2×100 mg/kg/day) を上回った。NCI-N87 (HER2+) xenograft (Fig 3c-d) では大型腫瘍を含めて near-complete regression、trastuzumab IV 20 mg/kg 週1回と同等。NCI-H1975 (L858R/T790M) xenograft (Fig 3e) では BIBW2992 20 mg/kg/day で T/C=12% vs gefitinib・lapatinib では効果なし、いずれも one-way ANOVA Dunnett’s test で p<0.01。これらは T790M 駆動 NSCLC に対する xenograft level の direct evidence を初めて提示した。
Bitransgenic L858R/T790M mouse で MRI 50%以上の腫瘍縮小、rapamycin 併用1週間でほぼ完全退縮を達成する： Tet-op-L858R/T790M EGFR/CCSP-rtTA bitransgenic mice (doxycycline-induced) は erlotinib に抵抗性 (Li et al. CancerCell 2007) であるが、BIBW2992 20 mg/kg/day 経口 4 週間で MRI 評価により >50% tumor reduction (4匹中 representative photo, Fig 4a, c)。Histology で treated lungs に decreased tumor foci + increased tissue space + fibrosis + pigment-laden macrophages を確認 (Supplementary Fig 2)。BIBW2992 単剤では完全寛解に至らなかったため、rapamycin 2 mg/kg/day i.p. を1週間併用した group では 6匹中で near-complete tumor regression を達成 (Fig 4b-c, Student’s exact t-test p<0.05)。IHC で BIBW2992 単独投与は pEGFR・pHER2・pHER3 を抑制、rapamycin 併用で pS6 (mTOR signaling biomarker) が dramatic に低下した (Fig 4d)。これは EGFR-PI3K-mTOR 軸を同時阻害することで T790M 駆動腫瘍を near-complete に退縮させられることを初めて in vivo で示した。
考察/結論
本研究は covalent irreversible dual EGFR/HER2 inhibitor BIBW2992 (Boehringer Ingelheim 化合物番号、後の afatinib) を体系的に前臨床評価し、T790M を含む第一世代 EGFR-TKI 耐性 NSCLC への broad-spectrum 抗腫瘍効果を in vitro kinase assay から in vivo bitransgenic mouse model まで一貫して証明した。(1) 既存研究との違い：先行研究では Kobayashi 2005 や Pao 2005 が T790M を identification するに留まり、Kwak 2005 や Greulich 2005 が irreversible EKB-569 を proof-of-concept として提示したが、selectivity・HER2 dual targeting・transgenic model 検証の3点で limitation を残した。HKI-272 (neratinib) は L858R/T790M murine model で mixed result でありrapamycin 併用が必要であった (Li et al. CancerCell 2007)。本研究の BIBW2992 はこれら先行 irreversible inhibitor と異なり、(a) covalent binding を EGFR Cys773 + HER2 Cys805 の2 cysteine 同時に行う独自設計、(b) lapatinib 比 285倍以上 (L858R/T790M 14 vs >4000 nM) の T790M 活性、(c) 単剤で transgenic mouse 50% 退縮 (HKI-272 は単剤限界がより低い) を達成した点で対照的なclass-leading profile を示した。(2) 新規性：本研究で初めて、(a) IC50 10 nM という single-digit nM レベルでの L858R/T790M 阻害を達成、(b) HER2 776insV exon 20 insertion 駆動 NSCLC (NCI-H1781) への efficacy を実証、(c) bitransgenic L858R/T790M model で MRI 縦断 imaging で抗腫瘍効果を quantitative documentation、(d) rapamycin 併用での near-complete regression という EGFR-PI3K-mTOR 同時阻害の preclinical evidence を提示。(3) 臨床応用：本研究の preclinical data に基づき Phase II 臨床試験 (LUX-Lung series) が同時並行で進行中であり、その後 afatinib は LUX-Lung 3/6 試験で EGFR exon 19 del/L858R 患者の一次治療標準として承認、LUX-Lung 8 で扁平上皮肺癌 erlotinib 比較 OS 延長を示し、現在 EGFR exon 20 insertion を含む uncommon mutation (LUX-Lung 2/3/6 pooled analysis、Yang 2015) や osimertinib 後のスクリーニングでも臨床利用される。臨床現場では T790M 駆動 acquired resistance が osimertinib (third-generation) で第一選択となった後も、HER2 exon 20 や uncommon EGFR mutation で BIBW2992/afatinib が選択肢として残り、本研究は bench-to-bedside で30年以上の標的治療開発史において重要な礎石論文となった。(4) 残された課題：(a) KRAS 変異 NSCLC (A549 cells) は BIBW2992 抵抗性で、KRAS 駆動例は適応外、(b) MET 増幅由来 acquired resistance (Engelman et al. Science 2007) は BIBW2992 単剤では HER3 phosphorylation 経由でも対処困難で、MET co-inhibition (capmatinib/tepotinib + osimertinib 等) が必要、(c) Bitransgenic mouse model は最終的に4匹/6匹と少数で統計的 robustness の追加検証が今後の検討事項、(d) Wild-type EGFR への 0.5 nM 高活性は皮膚毒性 (rash) や下痢の dose-limiting toxicity の機序的基盤であり臨床用量設計の制約として残された、(e) afatinib の osimertinib への置換 (third-generation EGFR-TKI で wild-type EGFR sparing が改善) という今後の研究の方向性が示された、(f) Limitation として preclinical model は immune system を反映せず、後発の osimertinib + ICI 併用 (ATLAS など) のような腫瘍微小環境を考慮した試験は当時は実施できなかった。
方法
In vitro kinase assay: human EGFR (Ullrich 1984) wild-type と L858R/T790M double mutant の tyrosine kinase domain を Glutathione-S-transferase (GST) と融合し精製抽出 (L858R 単独は Upstate Charlottesville VA 製を購入)。HER2 kinase domain (Coussens 1985) は baculovirus system で同様に発現。50% Me2SO に serial dilution した阻害薬、random polymer pEY (4:1, Sigma) を substrate、biotinylated pEY を tracer として活性を測定。Lapatinib・canertinib・gefitinib・erlotinib も WO patent disclosure に従って合成。Cellular phosphorylation ELISA: A431 (epidermoid carcinoma、wild-type EGFR)、NIH-3T3 (wild-type HER2 transfected)、BT-474 (breast cancer endogenous HER2)、NCI-N87 (gastric cancer endogenous HER2)、T47D (HER3 evaluation) を 1×10⁴/well で 96-well に播種。Anti-EGFR-biotin/HER2 抗体 coated plate に 1×10⁴ または 2×10⁴ cell lysate を transfer、450 nm extinction で読み取り、PRISM (GraphPad) で非線形回帰し IC50 算出。NIH-3T3 soft agar anchorage-independent growth assay: wild-type または mutant EGFR (L858R、L858R/T790M、D770_N771insNPG、R108K) 発現 NIH-3T3 を 0.4% Select Agar (Gibco/Invitrogen) 上層に、DMEM + 10% calf serum + erlotinib/BIBW2992 (± 100 ng/mL EGF) と共に triplicate で 2 週間培養、10視野/條件で colony count。Ba/F3 IL-3-independent proliferation: ectopic EGFR mutant 発現 Ba/F3 cells を IL-3 非添加で培養し IC50 を測定。NSCLC cell line MTS assay: H1666 (wt EGFR)、H3255 (L858R)、NCI-H1975 (L858R/T790M)、HCC827 (E746_A750del)、NCI-H1781 (HER2 776insV)、A549 (KRAS G12S) を sea plaque agarose 0.3% suspension で 96-well 2 週間培養、Alamar Blue で fluorescence (extinction 544 nm/emission 590 nm) を測定、GraphPad Prism 3.0 sigmoidal Hill slope で IC50 算出。Xenograft model: 5-6週齢 athymic NMRI-nu/nu 雌マウス (21-31 g, Harlan) に A431/FaDu/NCI-N87/SKOV-3/H1975 cells 1-5×10⁶/100 μL を右脇腹皮下注射、40-130 mm³ で randomization 後 BIBW2992 (HP-β-CD/酢酸/Natrosol 製剤) 20 mg/kg を p.o. (oral gavage) 1日1回投与。Tumor volume = π/6 × length × width²。Trastuzumab は IV 20 mg/kg 週1回。Immunohistochemistry で pEGFR + pAKT を確認。Bitransgenic L858R/T790M mouse: Tet-op-L858R/T790M EGFR/CCSP-rtTA bitransgenic (Li 2007b) を doxycycline diet で 6 週間誘導、MRI で肺腫瘍同定後 BIBW2992 20 mg/kg/day 経口 4 週間 ± rapamycin 2 mg/kg/day i.p. を投与し、MRI を 2/4 週で repeat、Image J でtumor volume 計測。Statistics: unpaired two-tailed Student’s t-test または one-way ANOVA + Dunnett’s multiple comparison test、p<0.05 を有意とした。