- 著者: Triparna Sen, B. Leticia Rodriguez, Limo Chen, Carminia M. Della Corte, Naoto Morikawa, Junya Fujimoto, et al.
- Corresponding author: Lauren A. Byers (MD Anderson Cancer Center)
- 雑誌: Cancer Discovery
- 発行年: 2019
- Epub日: 2019-04-01
- Article種別: Original Article (Basic/Translational Research)
- PMID: 30777870
背景
免疫チェックポイント阻害薬 (immune checkpoint inhibitor; ICI) は様々ながん腫で承認されてきたが、応答性はがん腫により大きく異なる。小細胞肺がん (small cell lung cancer; SCLC) は腫瘍変異負荷 (tumor mutational burden; TMB) が最も高いがん腫の一つにもかかわらず (Hellmann et al. CancerCell 2018 のCheckMate 032 TMB解析)、T細胞浸潤が低く抗原提示が減少する免疫抑制的微小環境 (immune-cold) を呈し、抗PD-1/PD-L1治療の奏効率は低い (Antonia et al. LancetOncol 2016 のCheckMate 032試験で nivolumab単剤奏効率10%)。
DNA損傷応答 (DNA damage response; DDR) 経路はSCLCで重要な治療標的として認識されている (Byers et al. 2012 CancerDiscovのproteomicsでPARP1高発現報告、Sen et al. 2017 ClinCancerResのCHK1阻害剤前臨床試験)。PARP阻害剤・CHK1 (checkpoint kinase 1) 阻害剤は他がん腫で承認/治験段階にあり、DNA修復・細胞周期制御に加え抗腫瘍免疫応答にも関与することが示唆されてきた。トリプルネガティブ乳癌 (triple-negative breast cancer; TNBC) 前臨床モデルでolaparib (PARP阻害剤) と抗PD-L1の相乗効果が報告された (Jiao et al. 2017 ClinCancerRes) が、SCLCではDDR標的とICIの相互作用機序は未解明であった。
何が足りなかったかと言えば、(1) SCLCでDDR阻害がPD-L1発現と免疫微小環境にどう影響するか、(2) その分子機序 (STING/cGAS自然免疫経路の関与) が直接実証されているか、(3) 免疫能マウスモデルでDDR阻害剤+ICI併用の前臨床効果が示されているか、の3点である。これらの解明はSCLCにおける合理的併用療法開発の基盤となる。
目的
SCLCにおいて(1) PARP/CHK1阻害がPD-L1発現と腫瘍浸潤T細胞 (tumor-infiltrating lymphocyte; TIL) に与える影響、(2) 抗PD-L1療法との併用効果と機序、(3) cGAS-STING-TBK1-IRF3自然免疫経路の関与、を in vitro + in vivo (immunocompetent SCLC mouse model) で系統的に検証する。
結果
DDR阻害がPD-L1発現を顕著に増加させる: ヒトSCLC cell line panelにprexasertib (300 nmol/L) またはolaparib (1 μmol/L) を72時間処理しRPPA解析で PD-L1蛋白を測定。prexasertibで最大5倍、olaparibで最大3倍のPD-L1上昇 (p<0.05、Fig 1A)。immunoblotでtime-dependent PD-L1上昇 (Fig 1B)、FACSによる細胞表面PD-L1もヒト (Fig 1C) ・マウス (RPP/mTmG、Fig 1D) cell lineで時間依存性増加 (p<0.05)。CHEK1またはPARPのsiRNA knockdownでも同様PD-L1上昇 (Supplementary Fig S1A-S1B)、second CHK1 inhibitor LY2603618でも再現 (Supplementary Fig S1C)。Micronuclei frequencyは prexasertib 1 μmol/Lまたはolaparib 10 μmol/L処理 24時間後に有意増加 (p<0.001、Fig S1D-S1E)、cytogenetic stressの直接実証。
CHK1阻害は免疫能マウスでより強い抗腫瘍効果: prexasertib 12 mg/kg b.i.d. (週合計48 mg/kg) を nude (ID) vs B6129F1 (IC) マウスRPP/mTmG flank tumorに投与。IC modelでの腫瘍増殖抑制はIDより有意に強い (p<0.001、Fig 1E)、IC modelでのPD-L1上昇はFold change (FC) 3.07、IDでは1.28にとどまる (Fig 1F, 1G)。lung autochthonous SCLC modelでprexasertib 10 mg/kg投与時点でPD-L1がtime-dependent上昇 (Fig S1F)、CD3+ T cell・CD8+ cytotoxic T cell浸潤増加 (Fig S1G-H、p<0.01)、PD-1+/TIM3+ exhausted T cell減少、CD44+ memory/effector T cell富化 (Fig S1J-L)。これはDDR阻害が直接的に腫瘍細胞死を促進するだけでなく、免疫微小環境を再構成することを示す。
Prexasertib + anti-PD-L1で10匹中6匹がCR: B6129F1 IC RPP/mTmG flank tumor (n=10/group) にprexasertib 10 mg/kg + anti-PD-L1 300 μg を週3週間投与。anti-PD-L1単剤群は抗腫瘍効果なく3週以内に腫瘍負荷過大で安楽死、prexasertib単剤群は腫瘍増殖遅延のみだったのに対し、併用群では1週間以内に顕著な腫瘍退縮、3週時点で10匹中6匹が完全奏効 (CR、100%腫瘍消失) (p<0.001、Fig 1H-J)。CD3+ T cell・CD8+ cytotoxic T cell浸潤が単剤より併用で有意に増加 (p<0.001、Fig 2A-D)、CD44+ memory/effector population拡大 (p<0.001、Fig 2E-F)、CD62L+ naïve T細胞減少 (p<0.001、Fig 2E-G)。Olaparib (50 mg/kg) + anti-PD-L1併用でも類似の相乗効果を確認 (Fig 3、Supplementary Fig S3)。
CD8 T細胞depletionで効果消失: anti-CD8抗体投与でCD8+ T cellを枯渇させた条件下では、prexasertib + anti-PD-L1の相乗抗腫瘍効果が完全に消失 (p<0.001、Fig 4)。これによりCD8+ cytotoxic T cellがDDR-ICI併用効果の必須エフェクター細胞であることを直接実証した。
STING/TBK1/IRF3経路がDDR-ICI効果を媒介: prexasertib・olaparib処理後のSCLC細胞 (H69・H446・RPP) でphospho-STING・phospho-TBK1・phospho-IRF3が顕著に増加 (immunoblot、Fig 5A-C)、cytosolic dsDNA量も増加 (Fig 5D)。STING経路下流のtype I interferon (IFN-α/β) ・CXCL10・CCL5の発現と分泌が増加 (ELISA・qPCR、Fig 5E-G)、これらケモカインがCD8+ T細胞遊走・活性化を駆動する分子的基盤を提供する。臨床的にもDDR pathway gene expressionは Texas SCLC patient cohort (TCGA SCLC含む) でSTING/IRF3 signature・CD8 T cell signatureと有意な正相関 (Spearman r > 0.4、Fig 5H-I)。
cGAS/STINGノックダウンで併用効果消失: shRNAでcGASまたはSTINGをknockdownしたRPP/mTmG cellをB6129F1マウスに移植、prexasertib + anti-PD-L1併用効果が完全消失 (vehicle群と同等、p<0.001、Fig 6A-D)。これはDDR阻害剤の免疫活性化作用がcGAS-STING-TBK1-IRF3 innate immune pathwayに完全に依存することを直接実証した。CXCL10・CCL5・IFN-β分泌もcGAS/STING-KD群で消失 (Fig 6E-G)。これにより、DDR阻害→DNA damage accumulation→cytosolic dsDNA → cGAS-STING → type I IFN → CXCL10/CCL5 → CD8+ T cell infiltration/activation の完全な分子経路が確立された。
考察/結論
先行研究との違い: 本研究はSCLCにおいて、これまで報告されていなかったDDR阻害剤の免疫活性化機序を直接実証した。先行のTNBC前臨床研究 (Jiao 2017) がolaparib+anti-PD-L1の相乗効果を示したのと対照的に、本研究はSCLC特異的な高TMB・neuroendocrine分化背景でDDR-ICI併用の効果を実証し、さらにcGAS-STING-IRF3経路への完全な依存性をsiRNA-KD実験で明示した点で異なる。SCLCのICI低応答性 (ニボルマブ単剤奏効率10%、Antonia et al. LancetOncol 2016) の機序的克服策を提示した。
新規性: 本研究で初めて、(1) PARP/CHK1阻害がSCLCにおいてPD-L1を最大5倍上昇させること、(2) prexasertib + anti-PD-L1併用が単剤無効SCLCで10匹中6匹のCRを達成すること、(3) 効果が完全にcGAS-STING依存的であること、(4) DDR阻害→cytosolic dsDNA→cGAS-STING→type I IFN→CXCL10/CCL5→CD8+ T cell infiltration の完全な分子経路、が示された。これは新規な「DDR阻害は単独でも抗腫瘍免疫を惹起する」という概念を確立し、これまで報告されていなかったDDR proteinsのimmunomodulatory機能を定義した。
臨床応用: 本研究の臨床応用上の意義は3点である。①PARP阻害剤 + ICI併用 (例: olaparib + durvalumab、Konstantinopoulos 2019、Krebs 2018) のSCLCにおける前臨床根拠を直接提供し、現行のMEDIOLA・JAVELIN等のpan-tumor試験のSCLC subgroupへの拡張を支持する。②CHK1阻害剤 (prexasertib、SRA737等) + ICIの臨床試験開発が新たな治療開発戦略として正当化される (現在NCT04209595等で開始済み)。③臨床的有用性として、STING pathway gene signature・cGAS発現・cytosolic dsDNA量は併用効果予測バイオマーカー候補となりうる。臨床現場ではこれまでICI低応答だったSCLCにDDR阻害剤を加える bench-to-bedside 戦略の理論的基盤となる。
残された課題 / limitation: 著者らが明示する今後の検討課題・limitationは以下である。①前臨床マウスモデル (B6129F1) からヒトSCLC患者への外挿には限界があり、phase I/II臨床試験での確証が今後の検討課題。②PARP/CHK1阻害剤の血液毒性 (好中球減少・血小板減少) とICIの免疫関連有害事象 (immune-related adverse event; irAE) の累積安全性プロファイルは今後の研究展望として残された。③SCLC分子サブタイプ (Rudin et al. NatRevCancer 2019 のSCLC-A/N/P/Y、Gay et al. CancerCell 2021 のSCLC-I) によるDDR-ICI併用応答性の差は本研究では未検証で、SCLC-I (inflamed) で最大の効果が期待されるが今後の課題である。④cGAS/STING経路下流のIRF3以外のtranscription factor (NF-κB等) の関与は限定的に検討されたのみ。⑤Limitation としてRPP modelはhuman SCLCの遺伝学的不均一性を完全には反映せず、ヒトpatient-derived xenograft (PDX)・organoidでのvalidationが必要である。
方法
ヒトSCLC細胞株: H69・H446 (SCLC-A type)・H82 (SCLC-N type) を主体に複数のヒトSCLC cell lineを使用。マウスSCLC細胞: RPP/mTmG cell (Rb1/Trp53/p130 triple-knockout マウスから単離した murine cell line)。
マウスモデル (genetically engineered mouse model; GEMM): (a) immunocompromised (nude) マウス vs immunocompetent (IC; B6129F1) マウスへの皮下移植flank tumor model、(b) Rb1/Trp53/p130 floxed (RPP) mice + intratracheal Ad-CMV-Cre による spontaneous lung SCLC model (4か月後に≥50 tumors/lungが発生)。
DDR阻害剤: prexasertib (CHK1阻害剤、in vitro 300 nmol/L、in vivo 10-12 mg/kg b.i.d. 2/7days)、olaparib (PARP阻害剤、in vitro 1 μmol/L、in vivo 50 mg/kg/day)、LY2603618 (確認用CHK1阻害剤)。
抗体療法: 抗PD-L1抗体 (300 μg/mouse、1/7days、day 3)、抗CD8抗体 (CD8 depletion)。
PD-L1発現解析: Reverse phase protein array (RPPA、protein level 5-fold変化までを検出)、immunoblot、FACS (cell surface PD-L1)。
Knockdown / Knockout: siRNA/shRNAでCHEK1・PARP・cGAS (cyclic GMP-AMP synthase)・STING (stimulator of interferon genes; TMEM173) ノックダウン。
STING経路解析: phospho-STING・phospho-TBK1 (TANK-binding kinase 1)・phospho-IRF3 (interferon regulatory factor 3) immunoblot、cytosolic dsDNA quantification、ELISAでCXCL10 (C-X-C motif chemokine ligand 10)・CCL5 (chemokine [C-C motif] ligand 5)・type I interferon (IFN-α/β) 測定。
Micronuclei (MN) assay: cytogenetic stress評価、DAPI染色で1,000 cellsあたりのMN frequency計数。
Flow cytometry: 多重カラーFACSで CD3+ T cell・CD8+ cytotoxic T cell・CD4+ helper T cell・PD-1+/TIM3+ exhausted T cell・CD62L+ naïve T cell・CD44+ memory/effector T cellを定量。
統計: Student’s t-test、ANOVA、p<0.05・p<0.01・p<0.001で有意水準、群あたりn=10匹 (in vivo combination experiment)。