- 著者: Rajan A, Heery CR, Thomas A, Mammen AL, Perry S, O’Sullivan Coyne G, Guha U, Berman A, Szabo E, Madan RA, Ballester LY, Pittaluga S, Donahue RN, Tsai Y-T, Lepone LM, Chin K, Ginty F, Sood A, Hewitt SM, Schlom J, Hassan R, Gulley JL
- Corresponding author: Arun Rajan / James L. Gulley (National Cancer Institute, NIH, Bethesda, MD)
- 雑誌: Journal for ImmunoTherapy of Cancer
- 発行年: 2019
- Epub日: 2019-09-11
- Article種別: Original Article
- PMID: 31639039
背景
胸腺上皮性腫瘍 (TET, thymic epithelial tumor) は胸腺上皮細胞由来の腫瘍であり、未成熟リンパ球の高度浸潤、および重症筋無力症・赤芽球癆等の傍腫瘍性自己免疫疾患を特徴的に伴う希少難治性悪性腫瘍である。転移性TET患者の治療選択肢は極めて限られており、白金製剤ベース化学療法後の標準的な後治療は確立していない。Pardoll et al. NatRevCancer 2012 はPD-1 (programmed death-1)/PD-L1 (programmed death-ligand 1) 軸が活性化T細胞の抑制を通じて抗腫瘍免疫応答を阻害する中枢的な免疫チェックポイント機序であることを示し、ICI (immune checkpoint inhibitor) 開発の理論的基盤を提供した。TETにおけるPD-L1発現については、Padda et al. JThoracOncol 2015 が胸腺上皮性腫瘍での広範なPD-L1高発現を報告し、Katsuya 2015およびYokoyama 2016のIHC (immunohistochemistry) 研究でも胸腺腫の23-68%・胸腺癌の70-75%にPD-L1発現が確認されており、PD-L1阻害による治療の生物学的根拠が強く支持されていた。抗PD-1抗体による胸腺上皮腫瘍治療については、Giaccone et al. LancetOncol 2018 が胸腺癌に対するpembrolizumab phase 2試験でORR (objective response rate) 22.5%を報告し、Cho et al. JClinOncol 2019 の胸腺腫・胸腺癌対象phase 2でも胸腺腫ORR 28.6%が示された。しかしながら、抗PD-L1抗体特有の胸腺腫に対する治療効果を前向きに評価したデータは不足しており、抗PD-1抗体と抗PD-L1抗体のどちらが胸腺腫の独特な免疫微小環境において優れた活性を持つかは不明であった。さらにTETに対するICI治療においては重篤なirAE (immune-related adverse event) が他の固形腫瘍とは異なる高頻度・異なるパターンで発現するとの報告があり、その予測バイオマーカーは未確立という gap in knowledge が存在した。胸腺腫は胸腺上皮の「promiscuous gene expression (乱雑な遺伝子発現)」による独特の中枢性自己寛容機構を有するため、PD-L1阻害がどのような免疫動態を引き起こし奏効とirAEがどのように関連するかも解明されていなかった。すなわち、(1) 胸腺腫に特化した抗PD-L1抗体の前向き有効性エビデンスの欠如、(2) irAE予測バイオマーカーの未確立、(3) 奏効-irAE相関の分子基盤の理解不足という3つのgapが残されており、既存のアプローチでは何が不足しているかを明確にするためのcontrolled evaluationが必要であった。
目的
NCT01772004 (avelumab JAVELIN [Joint Avelumab Investigation of Numerous Indications, multi-cohort phase I program] solid tumor) のTETサブグループ解析として、再発・進行性TET n=8 (胸腺腫7例、胸腺癌1例) に対するavelumab (MSB0010718C、ヒト型IgG1 [Immunoglobulin G1] 抗PD-L1モノクローナル抗体、MerkelCell癌・尿路上皮癌承認薬) の抗腫瘍活性・irAE頻度を前向きに評価し、奏効およびirAE発現に関連する組織内ならびに末梢血の免疫学的correlate (correlative biomarker endpoint) を同定することを目的とした。具体的評価項目は、(1) Cell-DIVE (Cell-level Digital In situ Visualization and Expression, GE [General Electric] Healthcare製 multiplexed tissue imaging platform) を用いた multiplex IHCによる腫瘍浸潤免疫細胞の空間解析、(2) 11色flow cytometryによる123種PBMC (peripheral blood mononuclear cell) 免疫サブセットの治療前後変化、(3) immunoSEQ (Adaptive Biotechnologies製) platform による TCR (T-cell receptor) Vβ CDR3 (complementarity-determining region 3) sequencingを用いたTCR repertoire diversity解析、(4) sunitinib前治療歴と奏効・irAE発現との関連性同定、の4点であった。
結果
事前PD-L1 IHC解析：胸腺腫はn=54中16/19 (84%)、胸腺癌は17/35 (49%) でPD-L1陽性 本試験開始に先立ち、保存TETサンプルn=54 (胸腺腫n=19 [WHO AB/B1/B2/B3/unclassified]、胸腺癌n=35; Masaoka stage IVB n=36・IVA n=16・III n=1・IIB n=1) のIHC解析を実施した。胸腺腫はPD-L1陽性n=16例 (84%)・PD-L1欠失n=3例 (16%) であった。胸腺癌はPD-L1強陽性n=17例 (49%)・focal陽性n=14例 (40%)・PD-L1陰性n=4例 (11%) であり、胸腺腫の方が胸腺癌より均一かつ高頻度のPD-L1発現を示した (Figure S1)。この高い発現率がavelumabの優先評価対象として胸腺腫を選定した臨床的根拠となり、PD-L1阻害に対する感受性の高さを示唆する重要な事前データとなった。
主要抗腫瘍奏効：胸腺腫ORR 57% (95% CI 18-90%)、単回投与後に3例が腫瘍縮小 (Fig 1, Table 2) 胸腺腫n=7の治療成績は confirmed PR (confirmed partial response) n=2例 (29%)・unconfirmed PR n=2例 (29%)・SD (stable disease) n=2例 (29%)・PD (progressive disease) n=1例 (14%) で、ORR = cPR + uPR = 4/7 (57%; 95% CI 18-90%)。胸腺癌n=1例はSDで18回投与継続。特筆すべきは奏効n=4例中n=3例 (患者1, 3, 6) がavelumab 1回投与後に腫瘍縮小30-48%を達成した点である (Fig 2a)。患者1 (WHO B3 thymoma, 20 mg/kg) は1回投与で最大48%縮小しcPR (response duration 14週)、患者8 (WHO B1 thymoma, 10 mg/kg) は10回投与でcPR (response duration 12週)、患者3 (WHO B2 thymoma, 20 mg/kg) は1回投与で30%縮小しuPR (17週)、患者6 (WHO B2 thymoma, 10 mg/kg) は1回投与で31%縮小しuPR (4週) であった (Table 2)。irAE発現により追加投与が不可能となった奏効3例でも14週以上の無増悪が少なくとも2例で維持された (Fig 1b)。奏効期間は患者1が14週・患者8が12週・患者3が17週・患者6が4週であり、irAEによる治療中断にもかかわらず持続的な腫瘍縮小が観察された。腫瘍縮小とsteroid開始の時系列解析 (Table S4) では、腫瘍縮小はsteroid開始前または開始後9-20日以内に観察されており、腫瘍応答がavelumab自体に起因することが確認された。
irAE profileと奏効の強い相関：奏効例irAE発現率 100% (4/4) vs 非奏効例 25% (1/4) (Table 3, Fig 2b) 治療関連grade 3 AE (adverse event) はn=3例 (38%)、grade 4はn=3例 (38%) に認められた。hyperkalemia grade 4 n=1例を除き全てのgrade 3-4 AEが「autoimmune disorder」に分類された。最重要な観察は、irAE発現率が奏効例 100% (4/4) vs 非奏効例 25% (1/4) と顕著な差を示したことであり、n=8の小規模試験のため統計的有意差の検証は行われていないが、irAE発現はavelumab奏効の強力な免疫学的surrogate markerとして機能した。具体的irAEの内訳: 筋炎n=3例 (CPK [creatine phosphokinase] 上昇・AST [aspartate transaminase]/ALT [alanine transaminase] 上昇・大腿部MRI [magnetic resonance imaging] でmyositis所見・EMG [electromyogram] で筋原性所見が2/3例に確認)、自己免疫性腸炎n=1例 (患者8, grade 3 diarrhea、colonoscopyでvillous blunting + active inflammationを組織確認)。最重症の患者6 (WHO B2 thymoma) は投与2日後より筋力低下と嚥下困難を呈し、投与後13日でICU (intensive care unit) 入室・気管内挿管・mechanical ventilationが必要となった。intravenous methylprednisolone 3回 + IVIG (intravenous immunoglobulin) 5回 + cyclosporine A (CsA, immunosuppressant) 連日投与で漸進的軽快したが、呼吸器回復は部分的かつ長期に及んだ (Fig 2b)。患者2 (WHO B3 thymoma) はbulbar weakness・facial diplegia・舌の力低下・hypophonia (低声)を呈した神経筋irAEが別途報告された。grade 1-2 AEとして疲労3/8例 (38%)・腫瘍疼痛1/8例 (13%)・背部痛1/8例 (13%) 等が観察された (Table 3)。奏効n=4例全例がsunitinib (multitarget kinase inhibitor) 前治療歴を有しており、sunitinib前治療歴がICI反応性およびirAE発現に関連している可能性が示唆された (Table S3)。
末梢血免疫サブセット解析：治療前ALC高値・B細胞/Treg/cDC/NK低値がresponder signature (Fig 3d, Fig 4a) PBMC n=8例 (responder n=4例・non-responder n=4例) で治療前後の123種免疫サブセットを11色flow cytometryで測定した。最も顕著な差異は治療前 (baseline) に認められ、responder群はnon-responder群と比較してALC (absolute lymphocyte count) が高値、B細胞・Treg (regulatory T cells)・cDC (conventional dendritic cells)・NK細胞の頻度が低い傾向を示した (Fig 3d)。例数n=8の小規模解析のためstatistical significanceはtrendに留まる。Unsupervised hierarchical clustering (log2変換・z-score正規化・Complete Method) によるheatmapでは、irAE発現n=5例 (うちresponder n=4例) が独立してclusterし、治療前PBMC phenotypeがresponder identificationに有用な可能性が可視化された (Fig 4a)。なお患者2 (non-responderだがirAEは発現) のbaseline免疫プロファイルはresponder群に近く、TregおよびB細胞が低値であった。steroid投与後のresponder群ではTreg減少 + MDSC (myeloid derived suppressor cells) 増加が全例で観察された (Figure S3)。
組織・TCR解析：腫瘍内CTL/NK浸潤増加・HLA class I up-regulation、responder群で高TCR diversity (Fig 3a-c, Fig 4b-c) 奏効例 (患者8) のCell-DIVE multiplex IHCで、post-treatment腫瘍組織ではmacrophage (CD68/CD163多種分化段階)・NK cell (CD16)・CTL (cytotoxic T lymphocyte; CD3+CD8+) 浸潤が顕著に増加し、HLA class I発現がup-regulateした (Fig 3a)。HLA class II発現は低レベルかつheterogeneousであった (Fig 3c)。患者1のpost-treatment biopsyでは、pre-treatment biopsyで胸腺細胞様immature T cell (TdT+CD1a+CD4+CD8+) 主体だったintratumoral infiltrateがmature CD8+ T cellへ置換されており、PD-L1阻害が中枢性自己寛容機構を破綻させてmature effector T cellの分化を促進する仮説と整合した (Figure S2)。TCR sequencingでは、pre-treatment PBMCのTCR repertoire diversity (immunoSEQ platform、top 25th percentileのunique clonotype数) がresponder + irAE群 (n=4) においてnon-responder群 (n=4) より高いtrendを示した (Fig 4b)。最重症irAEを発現した患者6が最高TCR diversityを示した。steroid投与後のPBMC解析が可能なn=3例では全例でTCR repertoire diversityが顕著に低下し、steroidによる免疫抑制がT-cell repertoireを縮小させることが定量的に実証された (Fig 4c)。
考察/結論
本試験はavelumab (抗PD-L1 IgG1 [Immunoglobulin G1] 抗体) が再発胸腺腫に対してORR 57%・confirmed PR 29%という高い抗腫瘍活性を有することを前向きに報告した。これまでの研究として、Giaccone et al. LancetOncol 2018 は胸腺癌対象pembrolizumab phase 2でORR 22.5%を報告し、Cho et al. JClinOncol 2019 のTET対象phase 2 (胸腺腫含む) でもORR 28.6%であったことと対照的に、本試験の胸腺腫ORR 57%は格段に高い奏効率であった。胸腺腫のPD-L1高発現率 (84%) と胸腺癌 (49%) との相違、および胸腺腫に特徴的な免疫微小環境が高奏効率の生物学的背景として考えられる。また既報の抗PD-L1抗体試験では他の固形腫瘍でこのような高頻度・独特なirAEパターン (筋炎・心筋炎・神経筋AE) は報告されていない点で、胸腺腫のirAE病態は本試験で新規に記述された。
本研究で初めて系統的に示された新規の知見として最も重要なのは、奏効例4/4全例 (100%) でirAEが発現した一方で非奏効4例中のirAE発現が1例 (25%) のみという強い相関であり、胸腺腫固有の免疫寛容機構の破綻がPD-L1阻害の抗腫瘍効果と自己免疫毒性の両方を同時に引き起こすという新規な概念が提示された。胸腺上皮はpromiscuous gene expression (乱雑な遺伝子発現) により多様な自己抗原を発現するため、PD-L1阻害によるeffector T cellのdisinhibition (抑制解除) が周辺筋・神経・心筋組織の自己抗原への攻撃を惹起するという機序仮説と整合する。さらに、これまで報告されていないICI前の免疫調節薬 (sunitinib) 前治療曝露が奏効とirAEの双方に関連する可能性を初めて示した。Thomas et al. LancetOncol 2015 でも示されたsunitinibの免疫調節作用 (Treg・MDSC減少) がICI反応性を高める免疫プライミング (immune priming) を引き起こした可能性があり、これは新規な免疫学的観点を提供する。
臨床応用・臨床的意義の観点では、胸腺腫に対する抗PD-L1抗体の高い抗腫瘍活性は本試験で明確に示されたが、irAEリスクが非常に高く (奏効例100%でirAE、うち1例はICU入室)、bench-to-bedsideへのtransitionには厳密なirAE管理プロトコルの標準化が不可欠である。Mammenら (Ann Rheum Dis 2019) が示した治療前の抗AChR (acetylcholine receptor) 自己抗体陽性 + B-cell lymphopeniaをmyositis発症の事前マーカーとする戦略が、現在NCT03076554で前向き検証中であり、これが確立されれば高リスク患者の同定に貢献する。また治療前baselineのALC高値・Treg/B細胞/cDC/NK低値というPBMCサブセット組み合わせの臨床的含意として、奏効とirAEのsurrogate markerとしての活用が今後のTET ICI試験で評価されるべきである。
残された課題として、n=8の小規模試験であり各correlate (B細胞、Treg、cDC、NK、TCR diversity) の統計的significanceはtrendに留まり、独立コホートでの再現性確認が今後の検討として最優先である。sunitinib primingとICI反応性の関連性の前向き検証、胸腺特異的irAE発現の分子機序解明 (B-cell mediated antibody-dependent vs T-cell mediated cytotoxic mechanism か)、irAE management protocolの最適化 (steroid + CsA + IVIGの最適用量・順序・escalation基準)、抗PD-L1 vs抗PD-1抗体の直接比較試験がいずれも未解決として残されており、更なる検討が必要である。NCT03076554 (avelumab in advanced TETs) の結果が、これらの疑問に重要なデータを提供することが期待される。
方法
試験デザイン・薬剤供給: NCT01772004 avelumab dose-escalation phase I試験 (JAVELIN solid tumor) のTETサブグループ単群解析。薬剤はCRADA (Cooperative Research and Development Agreement) によりEMD Serono (EMD [Emanuel Merck Darmstadt] Serono, Inc., Billerica, MA; Merck KGaA [Kommanditgesellschaft auf Aktien, German limited-share partnership]系列の国際バイオ製薬企業) よりNCI (National Cancer Institute) に供給。NCI IRB (Institutional Review Board) 承認取得、全例にwritten informed consent取得後に登録。
対象: 進行・再発TETで前治療1ライン以上 (systemic therapy 中央値3.5ライン [range 2-10])、ICI naïve、活動性自己免疫疾患なし。n=8 (胸腺腫7例 [WHO B1=1、B2=3、B3=3]、胸腺癌1例)。年齢中央値53歳 (39-76歳)、男性5例 (63%)、Masaoka stage IVB 7例 (88%)、胸腺摘出術7例 (88%)、胸部放射線治療7例 (88%)。
介入: Avelumab 10 mg/kg (n=5) または20 mg/kg (n=3)、60分 intravenous infusion、2週毎投与、disease progression または耐容不能毒性発現まで継続。
腫瘍・毒性評価: 腫瘍効果はRECIST (Response Evaluation Criteria in Solid Tumors) version 1.1で6週毎評価、毒性はCTCAE (Common Terminology Criteria for Adverse Events) version 4.0で評価。
組織解析: FFPE (formalin-fixed, paraffin-embedded) 切片のH&E (Hematoxylin and Eosin) 染色 + IHC (TdT [terminal deoxynucleotidyl transferase], CD1a, CD4, CD3, CD8, CD5, PD-1, PD-L1) による二者病理独立レビュー + Cell-DIVE multiplex immunofluorescence platform (FFPE単一切片上で60以上のmarkerをsingle-cell characterization) での免疫細胞空間解析 (CD3/CD4/CD8/CD45RO T cell; CD3/CD4/FoxP3 [Forkhead box P3] Treg (regulatory T cells); CD3/CD20/CD79 B/plasma cell; CD16 NK [natural killer] cell; CD68/CD163 macrophage; HLA [Human Leukocyte Antigen] class I/II)。試験開始前に保存TET検体n=54でIHCによるPD-L1発現評価を実施した。
末梢血・TCR解析: PBMCを11色flow cytometry (30 markers使用・123種immune cell subset定量) で治療前後に評価し、RStudioでlog2変換・z-score正規化後にunsupervised hierarchical clustering (Complete Method) でheatmapを生成した。TCR sequencingはcryopreserved PBMC由来DNAをQiagen DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Germany) で抽出後、NCI Genomics Core (Frederick, MD) のimmunoSEQ deep resolution platformで実施し、Repertoire size (top 25 percentileのunique clonotype数) を多様性指標とした。
統計解析: 主要集計はdescriptive statisticsに基づく。responder vs non-responder間の免疫サブセット比較はMann-Whitney U testで評価し、治療前後の変化はWilcoxon signed-rank testで検定した。奏効期間はKaplan-Meier法で記述した。本試験は探索的pilotデザインのため全解析はexploratory (hypothesis-generating) として位置づけ、多重検定補正は実施せず、結果はtrendとして解釈された。