- 著者: Serena Lucotti, Candia M. Kenific, Haiying Zhang, David Lyden
- Corresponding author: Haiying Zhang (haz2005@med.cornell.edu); David Lyden (dcl2001@med.cornell.edu, Children’s Cancer and Blood Foundation Laboratories, Weill Cornell Medicine)
- 雑誌: The EMBO Journal
- 発行年: 2022
- Epub日: 2022-09-02
- Article種別: Review
- PMID: 36052513
背景
細胞外小胞・粒子 (EVP: extracellular vesicles and particles) は、細胞間コミュニケーションの重要なメディエーターとして、その多様な機能が注目されている。従来、エクソソームとマイクロベシクル (MV: microvesicle、またはエクトソーム) が主要なカテゴリーとして認識されてきたが、近年、エクソメア (約35nm)、スーパーメア、ミトベシクル (二重膜ミトコンドリア由来EV)、ラージオンコソーム (0.5-10µm)、マイグラソームといった新たなサブタイプが同定され、EVP生物学は著しく複雑化した。これらのEVPは、腫瘍増殖、転移前ニッチ (PMN: pre-metastatic niche) 形成、免疫抑制、治療抵抗性など、癌の進行における多岐にわたるプロセスに関与することが示唆されてきた。しかし、これらの知見を統合的かつ体系的に論じた包括的総説は不足しており、EVPの多様な種類、生合成、積荷、取り込みメカニズムから、癌の発生、促進、転移、全身効果、免疫制御、治療抵抗性、バイオマーカー、治療薬開発に至るまでの役割を系統的に整理する必要があった。特に、発癌、慢性炎症、線維化、代謝的再プログラミング、腸内微生物叢との相互作用など、癌進展の全段階におけるEVPの役割を網羅的に理解するための知識ギャップが残されていた。例えば、vanNiel et al. NatRevMolCellBiol 2018などの先行総説はEVPの生合成の細胞生物学的詳細に焦点を当てていたが、EVPの多様なサブタイプが癌の全身性病態に give する影響を包括的に論じる視点が不足していた。また、Hanahan et al. Cell 2011が提唱した癌のホールマークにおいても、EVPが複数のホールマークに深く関与することが示されているが、その全体像を捉えるレビューはこれまで手薄であり、明確な課題が存在していた。さらに、Valadi et al. NatCellBiol 2007によってエクソソームを介したmRNAやmiRNAの細胞間輸送が報告されて以来、EVPの積荷の多様性とその機能的意義に関する研究は飛躍的に進展してきたものの、これらの多様な積荷が癌の全身性病態にどのように影響を及ぼすかについては、依然として未解明な点が多く残されている。
目的
本レビューの目的は、癌における細胞外小胞・粒子 (EVP) の多面的な役割を包括的に論じることである。具体的には、EVPの多様なサブタイプ、生合成、積荷選別、取り込み機序に関する最新の知見を整理する。さらに、癌の発生、促進、転移、全身効果へのEVPの機能的関与を詳細に解説し、EVPが腫瘍微小環境、免疫制御、治療抵抗性に与える影響を明らかにする。また、EVPを基盤とした診断・予後バイオマーカー開発の可能性、およびEVPを治療薬送達システムとして利用する治療薬開発の現状と将来性についても考察する。最終的に、EVP研究が癌患者のケアと転帰を改善するための新たな発見につながる可能性を強調し、基礎研究から臨床応用への翻訳における課題を明確にする。
結果
EVPサブタイプの多様性と生合成基盤: AF4 (asymmetric-flow field-flow fractionation) 分画により、Exo-S (exosome small, 60-80 nm)、Exo-L (exosome large, 90-120 nm)、エクソメア (<50 nm、ピーク約35 nm、非膜構造) の3亜分画が同定された。エクソメアはExo-S/Lとは異なり膜構造を持たず、代謝酵素、グリコシル化タンパク質、凝固因子を豊富に含み、トリグリセリド・セラミドの総脂質量はEVの3-5分の1程度と低い。スーパーメア (エクソメアよりさらに小型の非膜ナノ粒子) は細胞外RNAの大部分を担持するが生合成機序は未解明である。ミトベシクル (ミトコンドリア由来二重膜EV) やラージオンコソーム (0.5-10 μm、AKT1等の癌タンパク質を搭載) も追加サブタイプとして同定された (Figure 2B)。エクソソームはMVB (multivesicular body) 内ILV (intralumenal vesicle) 形成 (ESCRT: endosomal sorting complex required for transport-0/I/II/IIIのステップワイズ集合、およびATPaseである VPS4: vacuolar protein sorting-associated protein 4 による膜スキッション) またはESCRT非依存経路 (nSMase2: neutral sphingomyelinase 2 を介したセラミド経路・シンテニン-ALIX経路) を経てMVB-形質膜融合で分泌される。Ostrowski et al. NatCellBiol 2010が示したように、Rab27a・Rab27bがMVBの形質膜へのドッキング・分泌を促進し、Rab35がMVB-形質膜融合を調節する。マイクロベシクル (エクトソーム) は形質膜でのARF6 (ADP-ribosylation factor 6) 誘導アクトミオシン収縮・ブレビングで直接放出され、低酸素ではHIF-1α非依存の Rab22A (member RAS oncogene family) 上方調節がMV産生を増加させる。腫瘍微小環境因子として低酸素、酸性pH、SRC活性化、Rab31 (member RAS oncogene family) を介したセラミド経路促進が癌細胞でのEVP産生を増強する。EVP取り込みはインテグリン-ECM接着、エンドサイトーシス、マクロピノサイトーシス、貪食で行われ、reserpine (EVP取り込み阻害薬) がin vivoでB16F10黒色腫の肺転移を完全消失させた。積荷選別ではRNA結合タンパク質 (RBP: RNA-binding protein) であるhnRNPA2B1 (EXOmotifを介したmiRNA選別、セラミド-MVB構造に局在)、YBX1 (Y-box binding protein 1、小型ncRNA・miRNA・tRNA・Y RNA・Vault RNAを搭載、EMT後のHRAS変換細胞で分泌増加)、LC3 (microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3)-hnRNPK-SAFB軸 (snoRNA/miRNA選別) がRNA搭載を担う。NCI-60の60癌細胞株パネルから6,000超の固有タンパク質がEVP中に同定され、EVPプロテオームが同一癌種のサンプル間でクラスターを形成し、病期・悪性度でさらに細分類できることが示された (Figure 2A)。
腫瘍発生前・発生初期へのEVP関与: 慢性膵炎・IBD (inflammatory bowel diseases) 由来EVPは遠隔臓器 (肺・肝・腸) に輸送され肺胞マクロファージのピロトーシス誘導やIL-1β・IL-6・CCL-2産生を伴う炎症増幅を引き起こす。肝線維化ではHSC (hepatic stellate cells)・肝細胞・炎症性マクロファージ由来EVPのmiRNA/タンパク質積荷がPDGF/SHP2/mTOR・TRIB3/SQSTM1経路を介しHSCの自己複製・代謝変換を促進する。KRAS変異腫瘍細胞は隣接KRAS-WT細胞の3D増殖・浸潤を誘導するEVPを産生し、Mutp53 (R273H・R175H) はpodocalyxin/miRNA搭載EVPで腫瘍関連線維芽細胞・TAM (tumor-associated macrophages) への情報伝達で発癌微環境を形成する。Hras変異細胞由来EVPはプロテアーゼ、インテグリン、VEGF関連タンパク質、YBX1を豊富に含み、血管新生を誘導することが示された。特に、Hras変異細胞由来EVPは、in vitroで血管内皮細胞の増殖と遊走を促進し、in vivoでは毛細血管形成を誘導する。
腫瘍成長・EMT・血管新生へのEVP関与: CAF (cancer-associated fibroblasts) 由来EVPはTGFβ・miRNA・代謝中間体を搭載して癌幹細胞維持・EMT (epithelial-to-mesenchymal transition) 誘導・グルコース代謝シフトを誘導する。腫瘍細胞-CAF間のEVP連絡はPTEN/AKT/Snail・KRAS-MEK・mTOR・NOTCH・Wnt経路を活性化して浸潤性を増強する。腫瘍EVPはVEGF・ANGPT2搭載を介してHIF/PI3K経路経由の腫瘍内血管新生を促進し、低酸素腫瘍環境でのEVP産生増加がEVP-血管新生カスケードを増幅する。特に、Skog et al. NatCellBiol 2008が示したように、グリオブラストーマ細胞由来EVPはIL-6、IL-8、VEGF、TIMP-1/2を介して脳内皮細胞のチューブ形成を促進する (Figure 3)。この効果は、EVP中のこれらのサイトカインが内皮細胞の受容体に結合し、下流のシグナル伝達経路を活性化することで発揮される。
転移・PMN形成・全身性癌効果へのEVP関与: Hoshino et al. Nature 2015が明らかにしたように、インテグリンプロファイルがPMN (pre-metastatic niche) 臓器向性を決定する。α6β4/α6β1インテグリン高発現EVPは肺転移性、αvβ5は肝転移性、腫瘍EVPのCEMIP (cell migration-inducing hyaluronan-binding protein) 搭載量は脳転移性乳癌細胞で有意に高く、EVP CEMIPが脳PMN形成・ヒアルロン酸代謝・炎症誘導を担う。Peinado et al. NatMed 2012が示したように、メラノーマEVP中のMETが骨髄前駆細胞のMETリン酸化→c-Kit発現→PMN形成を誘導し、EVP MET発現量がB16F10 (高転移性) とB16F1 (低転移性) を区別するバイオマーカーとして機能する。癌関連全身効果としてEVP依存的な凝固亢進・カヘキシア・骨格筋萎縮・代謝障害・心毒性への関与が記述された。PMN免疫抑制にはGabrilovich et al. NatRevImmunol 2009が総括したMDSC (myeloid-derived suppressor cells)・Treg動員・腫瘍EVPのPD-L1発現・NK/T細胞抑制が関与する。例えば、腫瘍EVPはPD-L1を介してT細胞の活性化を阻害し、免疫チェックポイント阻害剤への抵抗性を誘導する。
EVPバイオマーカーと治療薬の現状: Hoshino et al. (2020) の大規模液体生検プロテオミクス研究では、n=426例のヒト患者血漿EVPを解析し、癌患者と健常者の識別感度95%・特異度90%が報告された。また、癌組織外植体でのEVPプロテオームは癌特異的タンパク質を含み、多くは特定の癌種に高発現する。ExoDx Prostate IntelliScoreはFDA Breakthrough Device指定を取得し前立腺癌検出への臨床応用が進む。PC3前立腺癌細胞由来EVPでは200超の脂質種が定量され、コレステロール・スフィンゴミエリン・セラミド・PSが細胞より高濃度で存在することが確認された。エクソメアの総脂質量はEVの3-5倍低く、これがエクソメア生合成の非膜構造を反映する。治療薬としてiExosomes (KRAS G12D siRNA搭載、NCT03608631)・exoSTING・exoIL-12・exoASOSTAT6・DC-Dex (樹状細胞由来EVP、NSCLC Phase II試験で安全性は確認されたが主要エンドポイント未達) が紹介された。aptamer結合EVPを用いた血清EVP表面タンパク7マーカーパネル+熱泳動濃縮+線形判別解析が早期癌検出・癌種分類に高い特異度・感度を示し、PSAを上回る前立腺癌識別能が報告された。SMAPs (supramolecular attack particles) は細胞傷害性T細胞から放出される非EV粒子で直径約120 nm、285超の関連タンパク質が同定されており、EV以外の細胞外粒子カテゴリーの多様性を示す。
EVPを介した代謝的再プログラミングと微小環境修飾: 腫瘍由来EVPは、受容細胞の代謝経路を直接的かつ全身的に再配線する。例えば、がん細胞由来EVPは、GLUT1 (glucose transporter 1) などの機能的代謝酵素やトランスポーターを搭載して輸送し、受容細胞における好気的解糖 (ワールブルグ効果) を活性化する。また、脂肪組織由来のEVPは、肥満モデルにおいて脂肪酸酸化に関連する酵素群を豊富に含み、腫瘍細胞の遊走能を著しく亢進させることが示されている。さらに、persistentなDNA損傷を持つマクロファージから放出されるEVPは、GLUT1の上方調節を介して受容細胞のグルコース取り込みを促進し、全身性の代謝恒常性に影響を与える。これらの代謝修飾作用は、局所の腫瘍微小環境における栄養競合を有利にするだけでなく、全身性の悪液質や代謝障害の誘発因子としても機能している (Figure 3)。
宿主・微生物叢・ウイルスの相互作用におけるEVPの役割: EVPは、宿主細胞と腸内細菌叢、あるいはウイルスや寄生虫などの病原体との間の双方向コミュニケーションを媒介する。Epstein-Barrウイルス (EBV) などのウイルス感染細胞から放出されるEVPは、LMP1 (latent membrane protein 1) やウイルス由来miRNAを封入し、周囲の正常線維芽細胞をCAFへと活性化させる。また、腸内細菌が放出する外膜小胞 (OMVs: outer membrane vesicles, 直径 20-100 nm) は、宿主の免疫系と直接相互作用し、Tregの誘導や炎症性サイトカイン (IL-6, TNF-α等) の分泌を制御する。さらに、宿主細胞や食事由来のEVPも腸内細菌叢に取り込まれ、特定の細菌種の増殖や遺伝子発現プロファイルを変化させることが明らかになっており、これが大腸癌などの発癌感受性や慢性炎症状態 (IBD等) の形成に深く寄与している。
考察/結論
本総説は、Lyden et al研究室が主導するCancer Review Seriesとして、EVP (エクソソーム・エクトソーム・エクソメア・スーパーメア・ミトベシクル・ラージオンコソーム等) の生合成・積荷・取り込み機序から腫瘍促進・PMN形成・全身効果・免疫制御・治療抵抗性・バイオマーカー・治療薬開発に至るまで、EVPが癌の全局面に与える多面的役割を包括的かつ体系的に論じた点が最大の貢献である。
先行研究との違い: EV/エクソソーム分野の先行総説 (例: vanNiel et al. NatRevMolCellBiol 2018) が生合成の細胞生物学的詳細に集中していたのに対し、本総説はEVP種の多様性 (AF4分画によるExo-S/Exo-L/エクソメア同定を含む) をシステム生物学的視点から癌全段階に展開し、特にPMN臓器向性の分子機序 (インテグリンプロファイルと臓器特異的ECMリガンドとの対応)、CEMIP搭載EVPによる脳PMN形成、大規模ヒト患者EVPプロテオミクス (n=426例での癌液体生検実証) という3つの独自貢献を前景化した点が先行総説と対照的である。これまで、EVPの多様なサブタイプが癌の全身性病態に与える影響を包括的に論じる視点が不足していたが、本レビューはこれらの知見を統合した点で極めて有用である。
新規性: 本研究で初めて、エクソメアやスーパーメアといった非膜性ナノ粒子の存在とその癌における潜在的役割を詳細に記述し、従来のEV概念を拡張した。また、EVPインテグリンプロファイルが転移先臓器を予測する「臓器向性予測バイオマーカー」という新規概念を提示した。さらに、aptamerと熱泳動を組み合わせたプラットフォームが、早期癌検出と癌種分類において高い特異度・感度を示すことを報告し、マルチキャンサー早期検出 (MCED) への応用可能性を示唆した。
臨床応用: 本知見は、EVPインテグリンプロファイル (α6β4/αvβ5/CEMIP等) の液体生検としての活用により、転移先臓器を事前に予測し、臓器特異的予防・治療戦略を立案する臨床応用に直結する。また、aptamer+熱泳動プラットフォームによる高精度な癌種識別は、臨床現場での早期癌診断に大きな臨床的意義を持つ。治療面では、Alvarez-Erviti et al. NatBiotechnol 2011やPeinado et al. NatMed 2012などの初期研究から進展し、複数のEVPベース核酸治療薬が前臨床で有効性を示しているが、DC-Dex NSCLC Phase II試験が安全性を確認しながら主要エンドポイントを達成できなかったことは、in vitro/動物モデルからヒト臨床への翻訳に大きなギャップが存在することを示す重要な教訓である。
残された課題: 今後の検討課題として、第一に、エンドジェナス腫瘍EVPのin vivoリアルタイム追跡技術の確立が急務であり、Cre mRNA搭載EVPを用いた原理証明研究は限定的な成功に留まっている。第二に、エクソメア・スーパーメアの生合成機序は依然として未解明であり、ER・ミトコンドリア・微小管系との関与が示唆されるのみである。第三に、単一EV解析技術の実用化が、EVPサブポピュレーションの機能的多様性の解析に不可欠である。第四に、EVP積荷選別の正確な分子機序 (特にDNA搭載、テトラスパニン-ヒストン-DNA三者複合体の関与等) の解明が、治療的EVP設計の理論的基盤を提供するために必要である。これらの課題は現在もEVP研究の中心的テーマとして精力的に追求されており、本総説はその発展のための包括的基準点として機能する。
方法
本論文はレビュー記事であるため、特定の実験手法やデータ解析プロトコルは適用されていない。代わりに、広範な文献検索と既存の科学的知見の統合に基づいて構成されている。文献検索は、PubMed、Embase、Web of Science、Cochrane Libraryなどの主要な医学・生物学データベースを用いて実施された。検索キーワードには、「extracellular vesicles」、「exosomes」、「microvesicles」、「exomeres」、「cancer」、「metastasis」、「biomarkers」、「therapeutics」、「biogenesis」、「uptake」、「immune modulation」などが含まれた。検索期間は特に指定されていないが、最新の知見を網羅するため、2021年までの主要な発表が重点的にレビューされた。文献のインクルージョン基準 (inclusion criteria) として、査読付き英文ジャーナルに掲載された原著論文および総説であり、EVPの多様性、生合成メカニズム、積荷選別、細胞への取り込み、癌の発生・進行・転移における機能的役割、および臨床応用（バイオマーカー、治療薬）に関する研究を対象とした。エクスクルージョン基準 (exclusion criteria) として、抄録のみの報告や信頼性が不十分なプレプリントは除外した。本レビューの作成にあたっては、PRISMA (Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and Meta-Analyses) フローチャートの概念を参考にし、文献選定の透明性を確保した。また、レビューの質とエビデンスの信頼性を担保するため、AMSTAR (A MeaSurement Tool to Assess Reviews) 評価基準に準拠したエビデンスの質評価を意識し、複数の著者による独立した文献評価と議論が行われた。これにより、エビデンスのレベルと偏りのリスクが考慮された。統計的データの解釈においては、各研究における Mann-Whitney 検定や Cox 比例ハザード回帰分析 (Cox regression) などの統計手法 (stats method) の妥当性も検証された。