- 著者: Shang-Chun Guo, Shi-Cong Tao, Helen Dawn
- Corresponding author: Shi-Cong Tao (Shanghai Jiao Tong University Affiliated Sixth People ’ s Hospital, Shanghai, China)
- 雑誌: Journal of Extracellular Vesicles
- 発行年: 2018
- Epub日: 2018-08-20
- Article種別: Review
- PMID: 30151077
背景
細胞外小胞 (extracellular vesicles: EV) は、血液、尿、唾液、脳脊髄液など、ほぼ全ての体液中に普遍的に存在し、起源細胞由来のタンパク質、核酸、脂質を内包するナノサイズの脂質二重層構造を持つ小胞である (Figure 1a)。EVは細胞間コミュニケーションの重要な担い手として機能し、細胞から不要物質を除去する役割を果たす一方で (Figure 1b)、抗原提示を介した免疫応答の調節にも関与することが、既に Raposo et al. JExpMed 1996 によってBリンパ球が抗原提示小胞を分泌することが示されており、その多様な生理機能は Robbins et al. NatRevImmunol 2014 が総説している。さらに、Valadi et al. NatCellBiol 2007 がmRNAやmiRNAの細胞間転送を報告したように、EVは細胞間での遺伝子情報の交換を担い、標的細胞の表現型を変化させる可能性も指摘されている (Figure 1d)。
これらの機能から、EVは診断・予後バイオマーカー、あるいは治療薬送達システム (drug delivery system: DDS) として近年大きな関心を集めている。しかし、EV研究に用いられてきた従来の単離・解析法には、手技の煩雑さ、長時間を要する処理、低スループット、回収率の変動 (2〜80%)、非EV粒子の混入、EV損傷のリスクといった多くの限界が存在する。例えば、超遠心法 (differential centrifugation: DC) はEVをサイズと密度に基づいて分離するが、絶対的な分離は不可能であり、EVの凝集やウイルス・タンパク質複合体の共精製、超遠心によるEV損傷のリスクが指摘されている。密度勾配超遠心 (density gradient centrifugation: DGC) はDCよりも純度が高いものの、低スループットであり臨床応用には不向きであるとされ、Thery et al. CurrProtocCellBiol 2006 がその課題を報告している。限外濾過 (ultrafiltration: UF) やサイズ排除クロマトグラフィー (size exclusion chromatography: SEC) は簡便だが、小型EVの損失やフォン・ヴィレブランド因子などの共精製が問題となる。免疫親和性捕捉 (immunoaffinity capture: IAC) は特定の表面抗原を持つEVサブポピュレーションしか捕捉できず、沈殿法は純度が低いという欠点がある。
これらの従来法は、高価な専用機器、大量のサンプル、低再現性、EVの生物学的機能への影響といった共通の制約を抱え、EVの持つ潜在能力を十分に引き出すことが困難であった。特に、EVの異質性を考慮したサブタイプごとの詳細な解析は、これらの方法では困難であり、EVの病態生理学的役割を深く理解し、臨床応用へと繋げるためには、より効率的かつ高精度なEVの単離・検出・解析技術の発展が不可欠であり、この領域には依然として技術的なギャップが未解明のまま残されていた。
一方、マイクロ流体工学 (microfluidics) は、マイクロリットル (µL) レベルの少量サンプルでの操作、低コスト、ハイスループット、高精度という顕著な利点を持つ。この技術は、EVの単離、検出、解析を単一の集積回路上で統合する「オンチップ」システムの実現に大きな期待をもたらしており、従来のEV研究における不足を補う新たなアプローチとして注目されている。
目的
本レビューは、マイクロ流体工学を利用した細胞外小胞 (EV) の単離・解析チップシステムの最新の進展を包括的にまとめ、その原理、性能、および臨床応用可能性を詳細に論じることを目的とする。特に、EVベースの液体生検やポイントオブケア (POC) 診断への展望に焦点を当て、将来的なクラウドベースのポータブル診断・モニタリングシステム、および人工知能 (AI) の関与についても考察する。
結果
本レビューは、マイクロ流体工学に基づくEV単離、検出、および解析システムの多様な進展を詳細にまとめている。これらの技術は、従来のEV研究における多くの課題を克服し、少量サンプルからの高精度かつ高スループットな処理を可能にしている。
EV単離技術の分類と従来法との比較： 本レビューは、EV単離技術を「層別化 (stratification) 」、「遮断 (interception) 」、「捕捉 (capture) 」の3つの指導思想に分類している (Figure 3)。従来のEV単離法、例えば超遠心法 (DC)、密度勾配超遠心 (DGC)、限外濾過 (UF)、サイズ排除クロマトグラフィー (SEC)、免疫親和性捕捉 (IAC)、沈殿法は、いずれもこれらの思想に基づくが、それぞれ固有の欠点を抱えている。DCはEVの凝集や非EV粒子の混入、回収率の変動 (2〜80%)、EV損傷のリスクといった限界がある。DGCは純度が高いものの、時間を要し低スループットであるため臨床使用には不向きである。UFは小型EVの損失が大きく、SECはフォン・ヴィレブランド因子などの大型タンパク質の共精製が問題となる。IACは特定のEVサブポピュレーションしか捕捉できず、沈殿法は純度が著しく低い。これらの従来法は、高価な機器、大量のサンプル、低再現性、EVの生物学的機能への影響といった共通の制約を持つ。これに対し、マイクロ流体工学に基づくオンチップシステムは、少量サンプル、短処理時間、低コスト、高精度という優位性を発揮し、これらの課題を克服する新たなアプローチを提供している。
マイクロ流体免疫親和性捕捉 (Mf-IAC)： マイクロ流体免疫親和性捕捉 (microfluidics-based immunoaffinity capture: Mf-IAC) は、EV表面の特定のマーカーを標的とする捕捉抗体を利用してEVを単離する技術である。この手法には、チャンネル内壁を捕捉抗体で修飾する方法と、捕捉ビーズを用いる方法の2つの主要なアプローチがある (Figure 2e, f)。内壁修飾型では、Chen et al.がherringbone grooveを用いた系を、Ashcroft et al.がマイカ表面修飾を用いた系を開発し、効率的なEV捕捉を報告した。さらに、Zhang et al.はY字型マイクロポストナノ構造インターフェースを開発し、捕捉表面積を拡大することで捕捉効率を向上させた。Kang et al.はwhirling機構を設計し、抗体とEVの結合確率を高めた。捕捉ビーズ型では、Dudani et al.が慣性溶液交換システムと捕捉ビーズを組み合わせた効率的なMf-IACシステムを開発した。Shao et al.は磁気捕捉ビーズを用いた磁気分離Mf-IACシステムを構築し、高収率でEVを単離した。Zhao et al.はserpentineチャンネルと磁気捕捉ビーズを組み合わせた系を開発し、診断上の有意な可能性を示した。ExoChipは、CD63抗体による捕捉と蛍光定量 (carbocyanine色素使用) を統合した最初のMf-IACシステムであり、0.5 pMという高い感度を達成した。捕捉ビーズを用いるMf-IACは、後続の解析への連携が容易であるという利点を持つが、既知の表面抗原を持つEVのみを単離可能であるという限界も存在する。
サイズ基盤マイクロ流体フィルター (Mf-F)： サイズ基盤マイクロ流体フィルター (microfluidics-based membrane filtration: Mf-F) は、EVの特定のサイズを利用して単離を行う。Davies et al.は、ナノポーラス膜を用いた圧力駆動型と電気泳動駆動型の2種類のMf-Fデバイスを開発した。電気泳動型は、圧力駆動型で約4 µLの濾液を得た後に発生する孔詰まりの問題を回避し、分離効率と純度を向上させた。Liang et al.は二重フィルター系 (200 nm膜で細胞や大型不純物を除去後、30 nm膜でタンパク質を通過させる) を構築し、超遠心法と比較してハイスループットかつ高収率で30〜200 nmのEVを単離した (Figure 2a)。Woo et al.が開発したExodiscは、20 nmと600 nmの孔径を持つ膜を使用し、小型EVと一部の大型EVを高収率かつ低タンパク質汚染で共単離することを可能にした。Liu et al.はモジュラー式のMf-FシステムであるExoTICを開発し、サイズに基づいてEVサブポピュレーションを単離できるプラットフォームを示した (Figure 2g)。Wang et al.は、多孔質シリコンナノワイヤーオンマイクロピラー構造のナノワイヤートラップ (nanowire-based traps: NT) システムを構築し、特定のサイズの粒子を選択的に捕捉するフィルターとして機能させた (Figure 2b)。これらのMf-Fシステムは、抗原に依存しないEV単離を可能にする点で、診断応用において特に有用である。
nano-DLD (ナノスケール決定論的側方変位) によるサイズ分離： nano-DLD (nano-sized deterministic lateral displacement) は、連続フロー中で粒子をサイズ別にリアルタイム分離するpillar-array型マイクロ流体デバイスである (Figure 2c)。Huang et al.が2004年にミクロン粒子 (0.8, 0.9, 1.0 µm) の分離に成功したことに始まり、ナノ粒子の分離は長年の課題であった。Zeming et al.は、バッファー溶液のイオン強度を調整することにより、2 µmのギャップを持つ大型DLDデバイスで51〜1500 nmのナノ粒子分離を実現した。真のnano-DLDシステムは、Wunsch et al.によって初めて構築され、25〜235 nmのギャップサイズを持つpillar配列を用いて、エクソソームとコロイドをサイズ依存的に分離することに成功した。この手法は、従来の超遠心法では不可能であったEVサブポピュレーションのリアルタイム分画を可能にする点で革新的であり、EVの異質性研究に大きく貢献する。
粘弾性フローおよび音響分離： 粘弾性フロー法は、粘弾性流体力学的な力を利用して、培養液や体液からEVを連続的、サイズベース、ラベルフリーで直接分離する手法である。この方法は90%以上の高純度と良好な収率を達成できるが、研究例はまだ少ない。音響分離系 (acoustic isolation) は、差分音響放射力に基づいて、圧縮率、直径、密度といった機械的特性の違いを利用してナノサイズの粒子を分離する (Figure 2d)。Lee et al.は、フロー方向に対して垂直な対称定在表面音響波を用いて、200 nm未満の小胞を分離することに成功した。Wu et al.は、細胞除去モジュールとEV単離モジュールを2段階で組み合わせるacoustofluidics技術を開発し、全血のような複雑なサンプルからの直接処理を可能にした。これらの非破壊的な単離法は、EVの生物学的活性を維持したまま単離できるため、その後の検出および応用にとって非常に重要である。
マイクロ流体検出系： EVを溶解せずにそのまま検出する「detection system」としては、蛍光イメージング、フローサイトメトリー (flow cytometry: FCM)、比色検出、表面プラズモン共鳴 (surface plasmon resonance: SPR)、微小NMR (miniaturised nuclear magnetic resonance: µNMR)、電気化学的手法が挙げられる。ExoChipは、蛍光色素を用いた検出で0.5 pMの感度を実現した (Figure 2h)。Friedrich et al.のナノフローチャンバーアレイは、170 fMまで小胞を正確にカウントできることを示した。Ko et al.は、スマートフォンを用いたポータブルなoptofluidicシステムを開発し、酵素増幅蛍光シグナルを検出した。FCMシステムも大きな可能性を秘めており、Zhao et al.はmulticolour FCMによりCA-125、EpCAM、CD24を多重測定した (Figure 2i)。比色法は、Woo et al.やLiang et al.がスマートフォンカメラを用いたOD測定で高いポータビリティを示した。SPRはラベルフリーバイオセンサー技術として注目され、Im et al.は透過型SPRシステムにより670 aM (atto-molar) という超高感度なラベルフリー検出を実現した。これは従来の検出限界を大きく超える感度であり、極少量臨床検体への応用を可能にする。Shao et al.のµNMRは、磁性ナノ粒子の超常磁性特性を利用してオンチップ単離後の多重タンパク型別を可能にし、神経膠芽腫治療のリアルタイムモニタリングに適用された。電気化学的手法では、Zhou et al.のアプタマーベースバイオセンサーがEV結合時のredoxシグナル低下を検出した。これらの検出システムは、EVバイオマーカーの早期診断や治療モニタリングにおける高感度化と簡便化に貢献する。
マイクロ流体解析系 (EVカーゴ分析)： EVを溶解して内容物を分析する「analysis system」では、タンパク質 (免疫化学発光) とRNA (オンチップRT-qPCR) の解析が実現されている (Figure 2j)。He et al.は、EpCAM陽性EVを磁気捕捉後、IGF-1RとpIGF-1Rを免疫化学発光で解析した。Shao et al.は、オンチップRNA抽出→逆転写 (reverse transcription: RT) →定量的PCR (quantitative polymerase chain reaction: qPCR) により膠芽腫の薬剤耐性関連mRNAを定量し、薬剤耐性モニタリングへの応用を示した。Richards et al.はRT-qPCRを用いてEV内miRNAを定量した。Ko et al.は、RNA発現プロファイルに機械学習アルゴリズムを適用し、がん、前がん、健常コントロールを区別することに成功した。これらの研究はまだ初期段階にあるが、EVの生物学的機能や病態生理学的役割を深く理解し、病態特異的なバイオマーカーを同定する上で極めて重要である。
統合オンチップシステムへの進展： ポイントオブケア (point-of-care: POC) デバイスへの関心が高まる中、単離から検出・解析まで一体化した統合マイクロ流体デバイスが複数開発されている。POCデバイス市場は2020年までに75.1億米ドルに達すると推定されており、迅速、高感度、使いやすさ、ポータビリティが求められる。ExoChipは、CD63抗体による免疫捕捉と蛍光定量 (プレートリーダー使用) を統合した最初のシステムである。その後、Dudani et al.やZhao et al.は、それぞれMf-IACと蛍光FCM検出を統合した。Zhao et al.のシステムは、CA-125、EpCAM、CD24の多重測定を可能にした。Friedrich et al.は、FCMベースの並列ナノチャンネルアレイを開発し、170 fMまでの小胞カウントを正確に実行できることを示した。Ko et al.は、スマートフォンを搭載したオンチップシステムを設計し、酵素増幅蛍光シグナルを検出することで、優れたポータビリティとアクセシビリティを実現した。比色検出システムも、Liang et al.がスマートフォンカメラで比色ELISAの結果を測定したように、ポータビリティと拡張性の点で有望である。SPRも、Im et al.が報告したように、多重化能力、高感度、高レベルの統合性を持つラベルフリーバイオセンサー技術としてリーダーとなる可能性を示している。さらに、He et al.は単離とタンパク質解析を、Shao et al.は単離とRNA解析を一体化したシステムを開発し、EVに関するより詳細な情報を提供している。Ko et al.は、RNAプロファイル解析に機械学習アルゴリズムを適用し、がん、前がん、健常組織を区別することに成功した (Figure 4)。将来的には、スマートフォン搭載POCデバイスとクラウドコンピューティング、人工知能 (AI) が連携し、EV液体生検データを遠隔地で専門医が解析する医療システムの構築が展望される。
考察/結論
マイクロ流体工学に基づくオンチップEVシステムは、ExoChip、nano-DLD、SPR、acoustofluidics、そして様々な統合チップといった複数の技術プラットフォームを通じて、従来のEV単離・解析法が抱えていた課題を克服しつつある。
① 先行研究との違い: 従来のEV単離法は、時間、コスト、純度、収率、EV損傷のリスクにおいて多くの課題を抱えていた。これまでの超遠心法や限外濾過法と異なり、マイクロ流体工学に基づくオンチップシステムは、これらの根本的な課題を克服し、少量サンプルからの迅速かつ高精度なEV単離・検出・解析を可能にする点で画期的である。特に、EVサブポピュレーションの特異的解析や、複合的なバイオマーカーの同時測定といった側面において、従来法では到達困難であった領域へのアクセスを可能にしている点が、大きな相違点である。例えば、超遠心法では回収率が2〜80%と変動が大きかったが、マイクロ流体システムはより高い再現性と効率を提供する。
② 新規性: 本研究で初めて、マイクロ流体技術がEVの単離、検出、解析にもたらした革新的な進展を包括的にレビューし、その多様な技術プラットフォーム（Mf-IAC、Mf-F、nano-DLD、粘弾性フロー、音響分離、各種検出・解析システム、統合チップ）を詳細に整理した。特に、nano-DLDによる25-235 nm範囲でのエクソソームのサイズ依存的リアルタイム分画や、SPRによる670 aM (atto-molar) というこれまで報告されていない超高感度なラベルフリー検出は、EV研究における新規な技術的ブレークスルーである。これらの技術は、EVの異質性をより深く理解し、特定のEVサブポピュレーションを標的とした研究を加速させる上で極めて重要である。例えば、Skog et al. NatCellBiol 2008 や Al-Nedawi et al. NatCellBiol 2008 が示したように、腫瘍由来EVは腫瘍特異的なカーゴを輸送するため、その高感度な検出は早期診断に不可欠である。また、Melo et al. Nature 2015 がグリピカン-1陽性EVによる早期膵臓がん検出の可能性を、Hoshino et al. Nature 2015 が腫瘍エクソソームインテグリンが臓器指向性転移を決定することを示したように、EVサブポピュレーションの特異的解析は病態解明に不可欠である。さらに、Kowal et al. ProcNatlAcadSciUSA 2016 がEVサブタイプ間のプロテオーム比較を行ったように、EVの異質性を考慮した解析は診断の精度向上に繋がる。
③ 臨床応用: EVは、その起源細胞の情報を反映するカーゴ（タンパク質、核酸、脂質）を保護・輸送するため、非侵襲的な液体生検における最も有望なバイオマーカーの一つである。悪性腫瘍の診断における「ゴールドスタンダード」である外科的生検が侵襲的で頻繁なサンプリングが困難であるのに対し、EVベースの液体生検は低侵襲であり、早期診断、治療効果モニタリング、再発予測において臨床応用の大きな可能性を秘める。マイクロ流体オンチップシステムは、少量血液や尿などの体液から高感度・高スループットでEVを単離・解析できるため、臨床現場におけるポイントオブケア (POC) 診断の実現に不可欠な技術基盤を提供する。さらに、スマートフォンとの統合や人工知能 (AI) によるデータ解析、クラウドコンピューティングとの連携は、遠隔地での疾患診断・モニタリングを可能にし、個別化医療や精密医療の進展に大きく貢献する臨床的意義を持つ。POCデバイス市場は2020年までに75.1億米ドルに達すると推定されており、この技術の重要性は増している。
④ 残された課題: EVベースの液体生検を臨床応用するためには、いくつかの残された課題が存在する。まず、体液からのEV単離・精製プロセスの標準化が不可欠であり、異なる施設間でのデータ比較可能性を確保する必要がある。次に、チップ製造のコスト削減と大規模生産技術の確立が、POCデバイスの普及には欠かせない。さらに、多施設共同研究による大規模な臨床バリデーションを通じて、診断マーカーとしてのEVの感度と特異性を検証する必要がある。また、EVの異質性を考慮した亜型特異的な単離・解析技術のさらなる高度化が今後の研究の重要な方向性である。例えば、Mf-IACとサイズ基盤法を組み合わせることで、特定の表面マーカーを持つEVサブポピュレーションを、そのサイズに基づいてさらに細分化するアプローチは、特異性と網羅性を両立させる有望な方向性であると考えられる。粘弾性フローや音響分離といった非破壊的単離法のさらなる研究も重要である。
方法
該当なし (Review)