- 著者: John R. Chevillet, Qing Kang, Ingrid K. Ruf, Hilary A. Briggs, Lucia N. Vojtech, Sean M. Hughes, Heather H. Cheng, Jason D. Arroyo, Emily K. Meredith, Emily N. Gallichotte, Era L. Pogosova-Agadjanyan, Colm Morrissey, Derek L. Stirewalt, Florian Hladik, Evan Y. Yu, Celestia S. Higano, Muneesh Tewari
- Corresponding author: Muneesh Tewari (Divisions of Human Biology and Clinical Research, Fred Hutchinson Cancer Research Center; Department of Internal Medicine, University of Michigan, USA)
- 雑誌: PNAS
- 発行年: 2014
- Epub日: 2014-09-29
- Article種別: Original Article
- PMID: 25267620
背景
エクソソームは、40〜100 nmの小胞として古くから知られており、様々な細胞種から分泌され、血漿、唾液、リンパ液、腹水、精液、羊水、脳脊髄液など多様な体液中に存在することが報告されてきた Raposo et al. JCellBiol 2013。近年、エクソソーム調製物中にマイクロRNA (miRNA) が存在することが報告され Valadi et al. NatCellBiol 2007、これらの小胞がmiRNAを介した細胞間コミュニケーションの担体として機能する可能性が示唆された。miRNAは特定の標的mRNAに結合してその活性を抑制することが知られており、全mRNAの60%以上がmiRNAによって制御されていると推定されていることから、エクソソームを介したmiRNA輸送が細胞機能に広範な影響を与えうるという仮説は非常に魅力的であった。さらに、エクソソームは由来細胞の表面タンパク質を提示し、受容細胞の表面受容体（例：ヘパラン硫酸プロテオグリカン）を介して内在化され、その内容物を転送することが報告されている Christianson et al. ProcNatlAcadSciUSA 2013。これにより、エクソソームを介したmiRNAの細胞間転送は、受容細胞の転写制御を迂回し、比較的直接的な調節手段を提供すると考えられてきた。実際に、実験条件下で精製エクソソームを受容細胞に送達する研究では、miRNAの転送が報告されており Kosaka et al. JBiolChem 2010、エクソソームを小型RNA送達ベクターとして利用する治療戦略も検討されている Alvarez-Erviti et al. NatBiotechnol 2011。
しかしながら、エクソソームを介したmiRNA転送が細胞間コミュニケーションの様式として魅力的な概念である一方で、現在のメカニズムモデルは詳細を欠き、このパラダイムの生理学的意義は未だ確立されていないという課題が残されていた。特に、個々のエクソソームが何分子のmiRNAを含むかという化学量論的な問いは、仮説の生物学的妥当性を評価するために不可欠であるが、エクソソームが回折限界以下の粒子（40〜200 nm）であり、光学顕微鏡や従来のフローサイトメトリーでは直接計数することが困難であったため、長らく未検討であった。透過型電子顕微鏡（TEM）による観察は可能であるものの Thery et al. CurrProtocCellBiol 2006、複雑なサンプル調製プロセスによる変動のため定量的なアプローチには不向きであった。このような背景から、エクソソーム中のmiRNA含有量を定量的に解析し、エクソソームを介したmiRNA細胞間コミュニケーションモデルの再評価を促すことが、生理学的意義を理解する上で不足している知識を補完するために重要であると考えられた。
本研究は、ナノ粒子トラッキング解析（NTA）技術の進展に着目した。NTAは300 nm以下の粒子を、光散乱を可視化しブラウン運動中の粒子を追跡することで定量的に解析できる技術である Dragovic et al. Nanomedicine 2011。また、微量核酸の絶対定量精度を向上させるデジタルPCR（ddPCR）の登場も、この化学量論的解析を可能にする重要な技術的進歩であった。本研究はこれらの技術を組み合わせることで、エクソソームとmiRNAの化学量論を初めて系統的に解析し、エクソソームを介したmiRNA細胞間コミュニケーションの既存モデルの再評価を促すことを目的とした。特に、前立腺がん患者血漿において、がん細胞がエクソソームとしてmiRNAを豊富に放出するという先行仮説が提唱されていたことから、この仮説の検証から出発し、広範な生体試料へと解析を拡張した。
目的
本研究の目的は、前立腺がん患者血漿および多種の生体試料（健常者血漿、健常者精液、臍帯血由来樹状細胞、マスト細胞株HMC-1、卵巣がん細胞株2008）から単離したエクソソームについて、ナノ粒子トラッキング解析（NTA）によるエクソソーム粒子数の絶対定量と、リアルタイムPCRおよびデジタルPCR（ddPCR）によるmiRNA分子数の絶対定量を組み合わせることで、エクソソーム1個あたりのmiRNA分子数（化学量論）を系統的に決定することである。この定量的知見に基づき、エクソソームを介したmiRNA細胞間コミュニケーション仮説の生物学的妥当性を再評価し、既存のメカニズムモデルを修正する必要があるかを検討する。さらに、循環miRNAバイオマーカーの物理的状態（エクソソーム関連か可溶性か）を定量的に評価し、エクソソームががん関連miRNAの主要な担体であるという先行仮説の検証も目的とする。
結果
循環miRNAのわずかな割合のみがエクソソームに存在することの確認: 転移性前立腺がん患者血漿 (n=9 patients) において、3種のがんバイオマーカーmiRNA (miR-141、miR-210、miR-375) と1種の対照miRNA (miR-16) をエクソソーム画分と超遠心後上清画分に分けて定量した。その結果、エクソソーム画分に存在するmiRNAの割合は、各miRNAで2.7% (miR-375) から5.6% (miR-141) にとどまった (Fig. 1C, Table S1)。さらに、420種のmiRNAを網羅したリアルタイムPCRアレイ解析 (n=3 pools, 各3 individuals) では、患者血漿中のmiRNAの中央値2.5%のみがエクソソーム画分に存在することが示された (Fig. 1D, Table S2)。この結果は、循環がんバイオマーカーmiRNAの大部分がエクソソームではなく、Argonaute2 (Ago2) などのタンパク質複合体として血液中に存在するという先行研究の知見と整合しており、エクソソームをmiRNAバイオマーカーの主要な担体とする先行仮説を定量的に否定するものであった。同様の結果は、患者血清 (n=3) および新鮮 (未凍結) 血漿 (n=6) から調製したエクソソーム画分でも得られ、結果が血漿に特異的ではなく、凍結によるアーティファクトでもないことを示した (Fig. S1, Fig. S2)。
多様な生体試料由来エクソソームの濃度とサイズ分布: 6種の異なる生体試料から単離したエクソソームのNTA定量値は、2桁の範囲にわたる多様性を示した。最低値は樹状細胞由来の6.06×10⁷エクソソーム/μLであり、最高値は精液エクソソームの7.79×10⁹エクソソーム/μLであった (Fig. 3)。NTAによるサイズ分布プロファイル解析では、粒子サイズがエクソソームと一致する集団が確認され、平均モード径は92 nm (マスト細胞) から122 nm (精液) の範囲であった (Fig. 3)。これは透過型電子顕微鏡 (TEM) による観察結果とも一致した (Fig. 2)。NTAによるエクソソーム計数の正確性は、PKH蛍光標識エクソソームと蛍光ビーズを用いた比較蛍光顕微鏡法による独立検証によっても確認された (8.9×10¹⁰ vs 1.3×10¹¹エクソソーム/mL、p=0.5619)。
1エクソソームあたりのmiRNA分子数：極めて低い化学量論: 全6試料および全miRNAを通じた1エクソソームあたりの平均miRNA分子数は、0.00825±0.02分子 (平均±標準偏差) と極めて低い値であった (Fig. 4, Table S5)。これは、1コピーのmiRNAを検出するために平均121個のエクソソームが必要であることを意味する。最も高い値を示したのは精液中のmiR-720で、約0.11分子/エクソソーム (1コピー/9エクソソーム) であった。一方、最も低い値は健常者血漿中のmiR-126で、約2.1×10⁻⁵分子/エクソソーム (1コピー/47,162エクソソーム) であった。この結果は、標準的なエクソソーム調製物中の個々のエクソソームの大部分が、特定のmiRNAを全く含まないことを強く示唆する。
miRNA定量における技術的バイアスの排除: miRNAの過小評価やエクソソーム数の過大評価の可能性を排除するため、いくつかの技術的要因を検討した。まず、エクソソームサンプルにおけるmiRNA増幅効率の低下の可能性について、合成スパイクインmiRNA (cel-miR-39およびUniSp6) を用いて評価した。エクソソーム画分と超遠心後上清画分のRNA抽出物間で、これらのスパイクインmiRNAの測定値に統計的に有意な差は認められなかった (cel-miR-39でp=0.1038、UniSp6でp=0.7587) (Fig. S3)。この結果は、エクソソームサンプル中にPCR阻害物質が共精製され、miRNA検出感度が低下している可能性を否定するものであった。
次に、エクソソーム調製物への他の粒子の混入によるエクソソーム数の過大評価の可能性を検討した。本研究では、細胞培養上清から体液まで多様な試料種別と異なる精製方法を用いたため、一貫して多量の汚染物質が混入する可能性は低いと考えられた。TEM画像でも、血漿由来エクソソーム調製物中に約10 nmの小型粒子 (おそらくHDL) が観察されたものの、これらはNTAの検出限界以下であり、マスト細胞株HMC-1や卵巣がん細胞株2008由来エクソソームではこのような小型粒子は観察されなかった。NTAで観察された粒子サイズのモード分布は、エクソソームの期待値およびTEM観察と一致していた。
第三に、リアルタイムPCRの標準曲線への依存によるmiRNA定量誤差の可能性を評価するため、デジタルPCR (ddPCR) による独立検証を実施した。ddPCRは標準曲線に依存せず、低存在量miRNAターゲットの定量において高い精度を示し、PCR阻害物質に対する耐性がある。健常者血漿エクソソーム中のmiR-223、卵巣がん細胞株2008エクソソーム中のlet-7bおよびmiR-720をddPCRとリアルタイムPCRで並行して定量した (Fig. S4)。miR-223とlet-7bの定量値は両手法間でそれぞれ1%未満および27%の差であり、統計的に有意な差はなかった (p=0.8861およびp=0.1696)。しかし、卵巣がん細胞株2008エクソソーム中のmiR-720は、ddPCRでリアルタイムPCRよりも70%低い値 (2.71×10⁻⁴ vs 9.16×10⁻⁴コピー/エクソソーム、p=0.0040) が示され、リアルタイムPCRがこのmiRNAを若干過大評価している可能性が示唆された。この結果は、本研究の主要な結論である「1エクソソームあたりのmiRNA分子数が1未満である」という知見をさらに補強するものであった。また、凍結融解によるエクソソームRNAの変化も、先行報告 (Kalra et al. 2013) との整合性から、結果に影響を与えないと判断された。
エクソソームmiRNA含有量に関する代替モデルの提唱: 本研究で観察された0.00825分子/エクソソームという化学量論は、「エクソソームが高濃度・高占有率のmiRNAを含む」という従来のモデル (高占有率/高濃度モデルおよび高占有率/低濃度モデル) のいずれとも矛盾する (Fig. 5A, B)。この結果に基づき、著者らは以下の2つの代替モデルを提唱した: (i) 低占有率/低濃度モデル: エクソソーム集団のごく一部が低濃度のmiRNAを含む (ランダム分布) (Fig. 5C)。(ii) 低占有率/高濃度モデル: ごく少数の「miRNAリッチ」エクソソームサブポピュレーションが多数のmiRNAコピーを保有し、集団全体の平均を著しく引き下げる (分布の右裾拡張型) (Fig. 5D)。もし細胞によるエクソソーム取り込みが選択的かつ低頻度であれば、後者のモデルが生理的miRNA通信を支持しうる。一方、マクロファージのような高速ピノサイトーシス細胞では、前者の低占有率/低濃度モデルでも、miRNAが細胞内で機能的に十分な量に蓄積する可能性も指摘された。
考察/結論
先行研究との違い: 本研究は、エクソソームがmiRNAを含むこと自体は2007年のValadi et al. NatCellBiol 2007の報告以来、多数の研究で報告されてきたが、「エクソソームがmiRNAを含む」という定性的な報告と、「生物学的に有効な量のmiRNAを含む」という問題は別であることを、初めて定量的に示した点でこれまでの研究と対照的である。また、循環miRNAの大部分がArgonaute2 (Ago2) タンパク質複合体として存在するという先行報告 (Arroyo et al. 2011) と本研究の知見は整合しており、循環miRNAバイオマーカー解析の文脈においても「エクソソーム」にこだわる必要性を再考するきっかけとなった。エクソソームの排除容積が細胞体積の0.0001%であることから、均一ランダムサンプリングではmiRNA含有が極めて希薄になることは理論的にも予測されうるが、本研究はその予測を実測データで裏付けた。
新規性: 本研究で初めて、多様な生体試料由来エクソソームについて、NTAとリアルタイムPCR/ddPCRを組み合わせた化学量論的解析を実施し、エクソソーム1個あたりのmiRNA分子数が平均0.00825分子と極めて低いことを定量的に明らかにした。この知見は、エクソソームを介したmiRNA細胞間コミュニケーションのメカニズムモデルに根本的な修正を迫るものであり、これまで報告されていない重要な発見である。
臨床応用: 本研究の知見は、miRNA液体生検においてエクソソーム画分を使用する際の検出限界が、エクソソーム単位でのmiRNAの希薄さによって本質的に制約されることを示唆しており、臨床応用におけるエクソソームベースの診断開発アプローチに重要な含意を持つ。また、エクソソームサブポピュレーション解析、特に「miRNAリッチ」な小画分の濃縮と解析の技術的必要性を先取りする知見であり、将来の単一EV解析技術（例：ナノフローサイトメトリー、プロキシミティバーコーディングアッセイ）の開発動機となった。さらに、エクソソームを用いたRNA治療薬のデリバリーにおいても、確実な積荷（cargo）を達成するためには、特定のmiRNAリッチエクソソームサブポピュレーションの選択的精製または人工的な積荷増強が必要であることを示唆する。
残された課題: 本研究で提唱された「低占有率/高濃度」モデル（少数のmiRNAリッチエクソソームサブポピュレーションの存在）は、単一EV解析技術（シングルEV RNAシーケンシング、シングルEVフローサイトメトリーなど）による直接的な実証が必要である。しかし、本研究実施時点ではそのような技術は利用できなかったため、今後の検討課題である。また、本研究はmiRNAのみを対象としており、mRNA、lncRNA、circRNAなど他のRNA種の化学量論は未解析である。より大型の細胞外小胞（マイクロベシクル、オンコソームなど）については、miRNAやより大型のRNAを生理学的に有意な数で運ぶ可能性も指摘されており、別途の検討が必要であることも著者らは指摘している。これらの課題は、エクソソームを介した細胞間コミュニケーションの全容を理解するために、今後の研究で取り組むべき重要な方向性である。
方法
試料種別とエクソソーム単離: 本研究では、6種類の多様な生体試料からエクソソームを単離した。(1) 健常者血漿 (n=3ドナー)、(2) 転移性前立腺がん患者血漿 (n=9患者)、(3) 健常者精液 (n=3ドナー)、(4) 臍帯血由来CD34+細胞から分化させたランゲルハンス細胞型樹状細胞 (n=3ドナー)、(5) マスト細胞株HMC-1 (n=2調製反復: 無血清培地およびエクソソーム除去血清添加培地)、(6) ヒト卵巣がん細胞株2008 (n=3調製反復)。血漿および卵巣がん細胞株由来エクソソームは、12,000×gで45分間遠心後、120,000×gで70分間遠心する差次超遠心法で単離した。樹状細胞および精液由来エクソソームは、スクロースクッション超遠心法を用いて精製した。細胞株由来エクソソームは、500×gで10分間遠心後、0.22 μmフィルターでろ過し、その後超遠心を行った。すべての研究は、各ドナーから書面によるインフォームドコンセントを得て、関連する施設内審査委員会（IRB）の承認を得て実施された。
エクソソームの確認: 単離されたエクソソームの形態とサイズは、透過型電子顕微鏡（TEM）を用いて確認した。各試料から得られた小胞は、エクソソームに一致するサイズと形態（モード径92〜122 nm）を示した。
エクソソーム粒子数定量（NTA）: エクソソーム粒子数の絶対定量には、NanoSight LM10（Malvern）を用いたナノ粒子トラッキング解析（NTA）を使用した。60秒間のビデオ画像を取得し、NanoSight NTA 2.3ソフトウェアで解析した。NTA値の独立した検証として、PKH蛍光標識エクソソームと既知サイズの蛍光ビーズとの比較蛍光顕微鏡法によるカウント（n=1試料の同一エクソソーム調製物で比較: NTA 8.9×10¹⁰/mL vs 蛍光顕微鏡法 1.3×10¹¹/mL、p=0.5619）を実施し、NTAの妥当性を確認した。
エクソソーム中の豊富なmiRNA同定: 各試料からmiRNeasyキット（Qiagen）を用いてRNAを抽出し、リアルタイムPCRアレイ（miRNA Ready-to-Use PCR Human Panel I, V2.M、Exiqon、420種miRNA）でmiRNAプロファイリングを行った。Ct値の昇順で上位5種のうち2種を、絶対定量対象miRNAとして選定した。
miRNA絶対定量（リアルタイムPCR）: 選定されたmiRNAの絶対定量は、合成cel-miR-39（外部スパイクイン）とUniSp6（逆転写スパイクイン）を内部標準とした標準曲線法に基づくリアルタイムPCRを用いて実施した。各試料・各miRNAについて、n≥3の独立サンプルで絶対定量値を算出した。
ddPCRによる独立検証: リアルタイムPCRの定量結果の正確性を確認するため、Hindson CM et al. (2013 Nat Methods) の既報法に従い、デジタルPCR（ddPCR）による独立検証を行った。エクソソームから抽出したmiR-223（健常者血漿）、let-7b（卵巣がん細胞株2008）、miR-720（卵巣がん細胞株2008）をddPCRとリアルタイムPCRで同時定量し、両手法の一致度を評価した。ddPCRは標準曲線に依存せず、低存在量miRNAターゲットの定量において高い精度を示し、PCR阻害物質に対する耐性があるため、リアルタイムPCRの潜在的な誤差を評価する上で有用であった。
化学量論算出: 各試料について、「miRNA絶対分子数」を「NTA定量エクソソーム数」で除することで、エクソソーム1個あたりのmiRNA分子数を算出した。
PCR増幅効率の確認: エクソソーム画分と上清（超遠心後上清）の各RNAサンプルにおいて、cel-miR-39およびUniSp6スパイクインのPCR測定値を比較し、PCR増幅効率に統計的に有意な差がないことを確認した（cel-miR-39でp=0.1038、UniSp6でp=0.7587）。これにより、エクソソームへのPCR阻害物質の共精製によるmiRNA過小評価の可能性を排除した。統計解析には、Prism 5.0cソフトウェアを用いて、Mann-Whitney U検定またはStudent t-testを実施した。