- 著者: Koji Fukuda, Shinji Takeuchi, Sachiko Arai, Ryohei Katayama, Shigeki Nanjo, Azusa Tanimoto, Akihiro Nishiyama, Takayuki Nakagawa, Hirokazu Taniguchi, Takeshi Suzuki, Tadaaki Yamada, Hiroshi Nishihara, Hironori Ninomiya, Yuichi Ishikawa, Satoko Baba, Kengo Takeuchi, Atsushi Horiike, Noriko Yanagitani, Makoto Nishio, Seiji Yano
- Corresponding author: Seiji Yano (Cancer Research Institute, Kanazawa University, Kanazawa, Japan)
- 雑誌: Cancer Research
- 発行年: 2019
- Epub日: 2019-02-08
- Article種別: Original Article
- PMID: 30737231
背景
ALK 遺伝子再構成 (主に EML4-ALK 融合) は非小細胞肺癌 (NSCLC) の約 3-5% に検出され (Soda et al. Nature 2007)、第 1 世代 ALK チロシンキナーゼ阻害薬 (TKI) クリゾチニブは奏効率 60%、無増悪生存期間 (PFS) 中央値約 12 か月という劇的な臨床効果を示した (Kwak et al. NEnglJMed 2010、Shaw et al. NEnglJMed 2013)。しかしほぼ全例で経時的に耐性を獲得し、約 20-25% で L1196M、I1171T/N/S、G1202R 等の多様な二次性 ALK 変異が、約 15-20% で HGF-Met、EGFR、c-KIT、IGF-1R、HER3 等のバイパスシグナル活性化が、その他 ALK 増幅・他の driver oncogene 獲得 (EGFR、BRAF)・血液脳関門 P-glycoprotein による薬剤到達不足が耐性機序として報告されている (Katayama et al. SciTranslMed 2012、Doebele et al. ClinCancerRes 2012)。
上皮間葉転換 (epithelial-to-mesenchymal transition、EMT) は腫瘍進展と多種の標的薬・細胞傷害性薬剤耐性の駆動因子として注目されており、EGFR 変異 NSCLC では EMT 関連 EGFR-TKI 耐性例は T790M 耐性例より予後不良であることが報告されている (Sequist et al. SciTranslMed 2011)。Gainor et al. (Gainor et al. CancerDiscov 2016) は ALK-TKI 耐性 NSCLC 12 例中 5 例で EMT 成分を検出し、うち 3 例で ALK 耐性変異も併存することを報告した。しかし「EMT と ALK 変異が単一細胞内で共存するのか、それとも独立した細胞集団として共存するのか」「EMT がドライバーとして耐性に直接寄与するのか単なる併存現象なのか」は未解明であった。さらに EMT 関連標的薬耐性に対する克服戦略が確立されていない という臨床的に決定的に 不足 した部分があり、ZEB1 を標的とする薬剤や miR-200 family 回復による EMT 反転の前臨床有効性検証は ALK 領域では未報告であった。
目的
本研究は (1) ALK-TKI 耐性 NSCLC 臨床検体において EMT 細胞と ALK 耐性変異が単一腫瘍病巣内でどのように分布しているかを laser capture microdissection (LCM) + digital PCR で空間的に解析し、(2) EML4-ALK 陽性肺癌細胞株からクリゾチニブ耐性かつ EMT 表現型を獲得した clone を樹立し、miR-200 family-ZEB1 軸が EMT-mediated ALK-TKI 耐性に必須であることを機構解明し、(3) HDAC 阻害薬 quisinostat による前処理が miR-200c 発現回復・EMT 反転を介して ALK-TKI 感受性を in vitro / in vivo で回復させることを実証することを目的とした。
結果
EMT と ALK L1196M ゲートキーパー変異の空間的独立性: クリゾチニブ治療前 (subclavian リンパ節生検) 検体ではほぼ全腫瘍細胞が E-cadherin 陽性 / vimentin 陰性の epithelial phenotype であり、ALK 耐性変異は検出されなかった (Fig. 1A)。一方、クリゾチニブ治療後の autopsy 検体 (原発肺・脳転移・皮下転移) では E-cadherin 陽性 / vimentin 陰性の epithelial 領域と E-cadherin 陰性 / vimentin 陽性の mesenchymal 領域が同一病巣内で共存し、すべての検体で ALK L1196M ゲートキーパー変異が検出された (Fig. 1A、Supplementary Fig. S1)。LCM で両領域を別個に採取し digital PCR で定量したところ、原発肺腫瘍では epithelial 領域に >12 copies/μg DNA の L1196M (全 ALK アレル中 27%) が、mesenchymal 領域には <2 copies/μg DNA (全 ALK アレル中 5% 未満) のみが検出され (Fig. 1D-E、n=5、P < 0.001)、皮下転移でも L1196M は epithelial 領域のみに検出された。腫瘍細胞のみを仮定するとmesenchymal 細胞の約 10% のみが L1196M を有し、残り 約 90% の mesenchymal 細胞は ALK 変異なしで crizotinib 耐性を獲得していた ことになる。これにより EMT 由来 mesenchymal 表現型が ALK 変異と独立した耐性メカニズムであることが患者レベルで確証された。
クリゾチニブ耐性 mesenchymal clone (#3、#4、#8) の樹立と pan-ALK-TKI 交差耐性: A925LPE3 を SCID マウス胸膜癌腫症モデルで crizotinib 連続曝露し、再発胸水から樹立した APE-CR cell line を limiting dilution して 15 clones を得、紡錘形 mesenchymal morphology を示す #3、#4、#8 を解析対象とした (Fig. 2A、親株は cobblestone-like epithelial)。MTT cell viability assay (n=3) で 8 は親 A925LPE3 と比較して crizotinib に 6 倍以上の耐性 (fold change > 6×) を示し、次世代 ALK-TKI である alectinib / ceritinib / lorlatinib にも交差耐性であった (Fig. 2B)。重要な所見として、crizotinib は 8 でも親株でも phospho-ALK を抑制したが、下流の phospho-AKT・phospho-ERK は親株では抑制されたものの 3 clones では持続活性化しており (Fig. 2C)、ALK 阻害は達成されても下流シグナル経路が脱共役した「ALK-independent」耐性であることが示された。ALK 特異的 siRNA knockdown は親株の viability を低下させたが 3 clones では viability に影響せず (Fig. 2D)、3 clones が ALK 非依存的に生存していることが確認された。Phospho-RTK array で EGFR / FGFR / HER3 / MET / IGF-1R / c-KIT / SRC のいずれも 3 clones で活性化されておらず (Supplementary Fig. S2A-C)、EGFR 阻害薬併用も crizotinib 感受性を回復させなかった (Supplementary Fig. S2B)。これによりバイパス受容体キナーゼ機序は除外され、別機序として EMT が示唆された。
EMT 表現型と miR-200c-141 → ZEB1 軸の同定: 3 clones では epithelial marker (E-cadherin、Zo-1、claudin1) が低下し、mesenchymal marker (vimentin、N-cadherin、ZEB1) が上昇していた (Fig. 3A-B)。Microarray analysis で #4 cells と親株間で 100 以上の EMT 関連遺伝子の差異を確認 (Fig. 3C、fold change > 2×)。Transwell migration assay でも 8 は親株より 3-5 倍多い細胞数が下層へ移動し (Fig. 3D-E、n=3)、機能的にも mesenchymal phenotype が確認された。重要な点として、TGFβ1 処理は H2228 では一部 EMT を誘導したが A925LPE3 / H3122 では誘導せず、SB431542 (TGFβ 阻害薬) も 3 clones の EMT を反転できず (Supplementary Fig. S3A-D)、MED12 (TGFβ pathway 制御因子) 発現は不変、PAI-1 / Smad7 等 TGFβ ターゲット遺伝子も不活性であった (Fig. 3A、Supplementary Fig. S3E)。したがって本 EMT は TGFβ 非依存的経路 で維持されていた。Snail1、Snail2、Twist (他の EMT 転写因子) は上昇せず ZEB1 のみが特異的に上昇しており、ZEB1-specific siRNA #1 / #2 で knockdown すると E-cadherin が回復し、crizotinib IC50 が #4 で 1.834 → 0.353 μmol/L (fold change ≈ 5×)、#8 で 1.15 → 0.210 μmol/L、#3 で 1.863 → 0.405 μmol/L まで低下した (Fig. 4A-B、Supplementary Fig. S4A-B、n=4)。MicroRNA profiling で miR-141 と miR-200c (miR-200 family) が #4 cells で親株より 10 倍以上低下していた (Fig. 4C、n=2、fold change > 10×)。miR-141 / miR-200c の overexpression で ZEB1 が低下し E-cadherin が回復 (Supplementary Fig. S5A)、これにより miR-200 family-ZEB1-E-cadherin 軸が EMT-mediated ALK-TKI 耐性の central regulator であることが特定された。
HDAC 阻害薬 quisinostat による miR-200c 回復と EMT 反転: 200 kinase inhibitor library での miR-200c-141 promoter activity screening (#4 cells に pNL2.2-miR200c reporter transfection、24 時間処理) で CUDC-101 (EGFR / HER2 / class I+II HDAC 阻害薬) が最強候補として浮上した (Fig. 4D)。Class I HDAC 阻害薬を 6 種比較し、第 2 世代 HDAC1/2 選択的阻害薬 quisinostat (JNJ-26481585) が CUDC-101 を上回って最強の miR-200c-141 promoter 活性化能を示した (Fig. 4E、n=3、P < 0.01)。Quisinostat 0.03 μmol/L 処理 (正常肺線維芽細胞 MRC-5 / IMR-90 で毒性なしの濃度、Supplementary Fig. S6A) で miR-200c および miR-141 の発現が 3-5 倍に上昇し (Fig. 4F、qRT-PCR、n=3、P < 0.01)、ZEB1 が低下、E-cadherin が回復した (Fig. 4G、5A、Western blot で時間依存的、5B 免疫蛍光)。AntagomiR-200c は quisinostat による ZEB1 抑制効果をキャンセルしたが antagomiR-141 はキャンセルせず (Fig. 4G)、quisinostat 効果は miR-200c 経由 が主であることが示された。Quisinostat 前処理 3 日 → crizotinib / alectinib / ceritinib / lorlatinib 3 日処理で 3 clones の crizotinib 感受性は親株と同等まで回復 (Fig. 5C、Supplementary Fig. S7)。E-cadherin-specific siRNA で E-cadherin 上昇をブロックすると quisinostat resensitization 効果も消失したことから (Fig. 5D-E、n=3)、quisinostat の resensitization は E-cadherin 回復を含む EMT 反転 に依存することが証明された。同様の効果は EGFR-mutant 耐性株 HCC827KGR (gefitinib 耐性) と H1975OR (osimertinib 耐性) でも観察され (Supplementary Fig. S8B-C)、quisinostat による EMT 反転戦略は ALK 領域だけでなく EGFR 領域にも拡張可能な普遍的アプローチであることが示された。
in vivo 胸膜癌腫症モデルでの quisinostat 前処理戦略の有効性: SCID マウス右胸腔内に #4 cells 1×10⁶ を接種、1 週後に crizotinib 50 mg/kg または alectinib 20 mg/kg を経口投与し pleural carcinomatosis の進展で耐性確認後、3 群 (ALK-TKI 継続、quisinostat 10 mg/kg × 5 日後 no treatment、quisinostat 10 mg/kg × 5 日後 ALK-TKI 再開、各 n=4) に無作為化。Quisinostat 単独群は day 32 で moribund (delays only) であり、ALK-TKI 単独継続群では pleural carcinomatosis は進行性であった (Fig. 6A-B)。Quisinostat 前処理後の crizotinib または alectinib 再開群では pleural carcinomatosis が著明に退縮し、CT で胸水消失も確認された (Supplementary Fig. S9B、P < 0.05)。腫瘍組織 Western blot で quisinostat 後の E-cadherin 上昇・vimentin 低下、IHC で E-cadherin 回復が親 A925LPE3 腫瘍レベルまで戻ることが確認された (Fig. 6C-D、Supplementary Fig. S9A)。体重減少等の毒性所見はなかった。これにより 「quisinostat 前処理 → second-generation ALK-TKI 再開」シーケンシャル療法が EMT-mediated ALK-TKI 耐性を克服する戦略 として in vivo で有効性が実証された。
考察/結論
本研究は EMT が ALK 変異状態と独立した ALK-TKI 耐性機序として機能することを単一患者検体の LCM + digital PCR 解析と前臨床 mesenchymal clone 機構解析の両面から体系的に示し、HDAC 阻害薬 quisinostat 前処理による miR-200c 回復が EMT 反転と ALK-TKI 感受性回復を可能にすることを in vivo まで実証した重要な translational research である。
① 先行研究との違い: 先行研究 Gainor et al. CancerDiscov 2016 は ALK-TKI 耐性 12 例中 5 例で EMT 成分を検出し ALK 変異 (3 / 5 例) との並存を報告したが、両者が同一腫瘍細胞内で共存するのか別細胞集団として共存するのかは未解明であった。本研究は先行研究とは 対照的 に LCM + digital PCR で単一病巣内の epithelial と mesenchymal 領域を空間的に分離して定量解析した点で これまでの Gainor らの correlation 研究と異なり、L1196M ゲートキーパー変異が epithelial 領域に 27% アレル頻度で集中し mesenchymal 領域には 5% 未満しか検出されない (fold change > 5×) という空間的隔離を明示した。さらに mesenchymal clone (#3/#4/#8) で ALK 阻害は phospho-ALK レベルで達成されるにもかかわらず phospho-AKT / phospho-ERK が持続活性化する「ALK shutdown だが下流持続」表現型を 本研究で初めて 明確化した点も、Gainor らの correlation 研究との相違である。TGFβ 経路を直接除外し (Kim et al. MolOncol 2013 の H2228 系では TGFβ 関与とは異なる)、miR-200c/ZEB1 軸を中心軸として確定した点も 新規な 知見である。
② 新規性: 本研究は 4 点の 新規な 知見を提供した。第一に、ALK 領域で 本研究で初めて clinical autopsy specimen で「EMT と ALK 変異の単一細胞レベル空間的隔離」を証明した (digital PCR で copy number レベル定量、n=5 各部位)。第二に、A925LPE3 由来 mesenchymal clone (#3/#4/#8) を樹立し pan-ALK-TKI 交差耐性 (crizotinib・alectinib・ceritinib・lorlatinib いずれも 6 倍以上耐性、fold change > 6×) を確認、ALK 阻害下でも AKT / ERK が持続活性化する EMT 特有 phenotype を機構解析した (これまで報告されていない novel な特性)。第三に、200 kinase inhibitor library screening + HDAC 阻害薬比較で quisinostat が最強の miR-200c-141 promoter 活性化能を持つことを系統的に同定した (CUDC-101 を上回る novel finding)。第四に、antagomiR-200c rescue experiment で 本研究で初めて quisinostat の作用が miR-200c 経由であり miR-141 経由ではないことを区別 (これは miR cluster 内の機能分担を区別した novel な解析)、E-cadherin siRNA rescue で resensitization が E-cadherin 含む EMT 反転に依存することを証明した。
③ 臨床応用: 本研究の 臨床応用 意義は、ALK-TKI 耐性後 re-biopsy で ALK 変異が検出されない症例 (相対的多数派) に対して、EMT が耐性主体である可能性を疑い、HDAC 阻害薬前処理 → ALK-TKI 再開という sequential therapy を選択する根拠を提供する点にある。Quisinostat 10 mg/kg × 5 日という短期間 pulsed 投与で in vivo 効果が得られたこと、体重減少なし、皮下毒性なし、という観察結果は臨床応用性を支持する。第 2 世代 ALK-TKI (alectinib、ceritinib、lorlatinib、brigatinib) いずれも EMT に対しては交差耐性であることが示されたため、現行 first-line alectinib (J-ALEX、ALEX) (Hida et al. Lancet 2017、Peters et al. NEnglJMed 2017) 失敗例にも応用可能性がある。HCC827KGR (gefitinib 耐性) と H1975OR (osimertinib 耐性) でも同様に有効であったため、EGFR 領域 EMT-mediated 耐性にも応用可能で、driver 不問の汎 EMT 耐性克服戦略として臨床試験 (HDAC 阻害薬 + 標的薬 sequential) の rationale となる。
④ 残された課題: 本研究で 残された課題 は (1) quisinostat による miR-200c 上昇の精密分子機序 (HDAC1/2 のどの基質脱アセチル化が promoter 活性化に直接寄与するか) が未解明で、今後の検討 で selective な miR-200c inducer の開発余地がある、(2) clinical proof-of-concept として ALK 陽性 NSCLC 耐性患者に対する HDAC 阻害薬 + ALK-TKI sequential 臨床試験は未実施 (quisinostat の血液毒性 profile を考慮した dose / schedule 最適化が 今後の課題)、(3) 患者 n=1 の autopsy 解析という limitation があり L1196M 以外のゲートキーパー変異 (G1202R 等) でも空間的隔離が成立するかは未検証、(4) first-line second-generation ALK-TKI 直接投与の耐性機序として EMT が占める頻度や、ALK 変異と EMT が単一細胞内で真に共存しないかをより大規模 cohort で 今後の研究 によって検証する必要がある、(5) EMT 細胞集団の clonal origin (耐性前から存在する mesenchymal cell の selection か、治療下での induction か) は未解明で、これは prevention vs reversion 戦略選択に影響する 今後の方向性 として 更なる検討 が残された。
方法
臨床検体解析: 剖検検体 (女性 ALK 再構成 stage IV 肺腺癌、subclavian リンパ節転移生検で診断、クリゾチニブで partial response 後 4 か月で急速進行死亡) から原発肺腫瘍・脳転移・皮下転移を採取。anti-ALK / anti-E-cadherin / anti-vimentin による IHC 染色で epithelial (ALK⁺/E-cadherin⁺/vimentin⁻) 領域と mesenchymal (ALK⁺/E-cadherin⁻/vimentin⁺) 領域を判別、29 枚 (5 μm/枚) のスライドから Micro Laser Systems MBIII (Carl Zeiss) で LCM 採取。Digital PCR: Bio-Rad QX200 Droplet Digital PCR (ddPCR) で LBx Probe ALK L1196M (A071) と APOB CNV プローブ (RIKEN GENESIS) を用い、ALK L1196M 変異コピー数と全 ALK アレル中のミュータント比率を上皮 / 間葉領域別に定量 (n=5)。細胞株: A925LPE3 (EML4-ALK variant 5a、E2;A20、男性日本人 stage IIIA 由来 A925L の腫瘍原性 variant)、H2228、H3122、HCC827、H1975、正常肺線維芽細胞 MRC-5 / IMR-90、薬剤 crizotinib / alectinib / ceritinib / lorlatinib / vorinostat / quisinostat (Selleck Chemicals)、SB431542 (TGFβ 阻害薬、Cayman)。クリゾチニブ耐性 clone 樹立: SCID マウス胸膜癌腫症モデルに A925LPE3 を 1×10⁶ 細胞接種、crizotinib 連続投与で再発、胸水から APE-CR cell line 樹立、limiting dilution で 15 clone 単離、紡錘形 mesenchymal morphology を示す #3、#4、#8 を選別。細胞アッセイ: MTT assay (2×10³ cells/well、96-well、crizotinib/alectinib 72 時間)、Western blot (anti-phospho-ALK Tyr1604、anti-phospho-AKT S473、anti-phospho-ERK1/2 T202/Y204、anti-E-cadherin、anti-ZEB1、anti-vimentin 等、Cell Signaling Technology)、Transwell 遊走アッセイ (1×10⁵ cells、24 時間)、siRNA transfection (Lipofectamine2000)、phospho-RTK array (R&D Systems ARY001B)。Reporter assay: miR-200c-141 promoter (1057 bp) を pNL2.2 [NlucP/Hygro] vector (4832 bp) に組込、Lipofectamine2000 で #4 細胞に transfection、24 時間処理後 NanoLuc 活性を Nano-Glo で測定、kinase inhibitor library 200 種 (Supplementary Table S1) で screening。qPCR: TaqMan MicroRNA Assay (miR-200c #002300、miR-141 #000463、RNU6B #001093 で normalize)、ViiA7 Real-Time PCR (Applied Biosystems)、2^-ΔΔCt 法。in vivo モデル: 5 週齢 female SCID mice (Clea)、#4 cell 1×10⁶/100 μL を 27-G 針で右胸腔内接種、1 週後に crizotinib 50 mg/kg または alectinib 20 mg/kg 経口投与、3 群に無作為化 (ALK-TKI 継続、quisinostat 10 mg/kg × 5 日後 no treatment、quisinostat 10 mg/kg × 5 日後 ALK-TKI 再開)、IVIS Lumina XR で luciferase 活性を週 2 回測定、n=4/群。倫理委員会承認下 (Kanazawa University)。統計: Student’s t-test (P < 0.05、P < 0.01、P < 0.001)、cell line authentication は STR 解析 (National Institute of Biomedical Innovation, Osaka)、Mycoplasma は MycoAlert Detection Kit で screening。