- 著者: Mark A. Lemmon, Joseph Schlessinger
- Corresponding author: Mark A. Lemmon (University of Pennsylvania School of Medicine); Joseph Schlessinger (Yale University School of Medicine)
- 雑誌: Cell
- 発行年: 2010
- Epub日: N/A
- Article種別: Review
- PMID: 20602996
背景
受容体型チロシンキナーゼ (RTK, receptor tyrosine kinase) は、細胞表面に発現して細胞の増殖、分化、生存、代謝、遊走、および細胞周期制御を司る極めて重要な制御因子である。ヒトゲノム中には n=58 種類の RTK が存在し、これらは構造的特徴に基づいて 20 サブファミリーに分類されている。すべての RTK は、細胞外のリガンド結合ドメイン、単一の疎水性膜貫通 α ヘリックス、および細胞内のチロシンキナーゼドメイン (TKD, tyrosine kinase domain) と C 末端・近膜領域 (JM region, juxtamembrane region) から構成される共通の分子アーキテクチャを有している。
RTK の全体的なトポロジー、活性化機構、および下流のシグナル伝達経路は、線虫 (C. elegans) からヒトに至るまで進化的に高度に保存されており、多細胞生物の恒常性維持における重要性を裏付けている。RTK の遺伝子変異や発現異常によるシグナル伝達経路の異常活性化は、がん、糖尿病、炎症、重篤な骨疾患、動脈硬化、および血管新生などの多様な疾患の直接的な原因となる。特に、EGFR (epidermal growth factor receptor) の活性化変異が非小細胞肺がん (NSCLC) 患者におけるゲフィチニブ (gefitinib) への高感受性を規定することが Lynch et al. NEnglJMed 2004 により示され、がん治療における標的分子としての地位が確立された。さらに、Blume-Jensen et al. Nature 2001 などの先行研究によって、がんにおけるチロシンキナーゼ活性化の普遍的な役割が提唱されてきた。
しかしながら、本総説が執筆された 2010 年の時点において、以下の重要な課題が残されていた。第一に、RTK ファミリー間における活性化機構の多様性が十分に整理されておらず、単一の「リガンド誘導性二量体化」モデルのみでは説明できない例外的な挙動が多数存在しており、詳細な分子機構は未解明であった。第二に、ErbB ファミリーにおける「受容体主導型 (receptor-mediated)」二量体化と、他の RTK における「リガンド主導型 (ligand-mediated)」二量体化の構造生物学的な相違点が体系的に統合されていなかった。第三に、キナーゼドメインの自己抑制 (autoinhibition) を解除する分子機構が、受容体ごとにどのように異なるのかという点について、包括的な比較が不足していた。さらに、下流シグナルネットワークのシステム生物学的なダイナミクス (正負のフィードバックループやクロストーク) と、臨床における薬剤耐性獲得機構との相関関係を橋渡しする包括的な知見の統合が手薄であり、構造-機能相関の理解において重大な knowledge gap が存在していた。本総説は、これらの不足している知識を補い、構造生物学からシステム生物学、さらには臨床医学に至る多角的な視点から RTK 制御機構を統合的に整理することを目的として執筆された。
目的
ヒトに存在する n=58 種類のすべての RTK および 20 サブファミリーを対象とし、最新の X 線結晶構造解析などの構造生物学的知見と機能解析データを包括的にレビューすることを目的とする。具体的には、(1) 細胞外領域におけるリガンド誘導性二量体化の 4 つの代表的モードの分類、(2) 細胞内キナーゼドメインにおける自己抑制機構の多様性 (特に EGFR における activation loop のリン酸化を必要としない CDK/cyclin 様アロステリック活性化機構の解明)、(3) 活性化された RTK が下流シグナルを駆動する際のマルチドメイン相互作用とシステム生物学的ネットワーク (ボウタイ構造やフィードバック制御) の体系化、(4) 臨床における病的変異 (EGFR L858R や T790M など) の構造的基盤の理解と、それに基づく分子標的治療薬 (抗体薬、可逆的/不可逆的 TKI) の合理的設計への応用について、一貫した統合的フレームワークを提供することを目的とする。
結果
共通構造アーキテクチャと 20 サブファミリーの分類: ヒトゲノムには n=58 種類の RTK がコードされており、これらは細胞外ドメインの構造的特徴に基づいて 20 サブファミリーに分類される (Fig 1)。すべての RTK は、(1) 細胞外のリガンド結合ドメイン、(2) 単一の膜貫通 α ヘリックス、(3) 細胞内のチロシンキナーゼドメイン (TKD) および近膜領域 (JM 領域)、C 末端テールという共通のトポロジーを共有している。活性化状態における TKD の結晶構造は、すべての RTK サブファミリー間で極めて類似しており、触媒活性に必要な αC ヘリックスや活性化ループ (activation loop) が特定の活性型コンフォメーションをとる。しかし、不活性状態における TKD の構造は受容体ごとに著しく異なっており、これが各受容体に固有の多様な自己抑制機構の構造的基盤となっている。例外として、インスリン受容体 (InsR) および IGF1R は、リガンド非存在下でもジスルフィド結合によって連結された (αβ)2 二量体として細胞表面に存在し、リガンド結合に伴う構造変化によって活性化される。
細胞外領域におけるリガンド誘導性二量体化の 4 つのモード: 結晶構造解析により、RTK の細胞外領域における二量体化機構は、以下の 4 つの明確なモードに分類されることが明らかになった (Fig 2)。
- (A) 完全リガンド主導型 (TrkA): NGF 二量体が 2 分子の TrkA の Ig-C2 (immunoglobulin-like C2-type) ドメインに結合して架橋するが、受容体同士の直接的な接触は存在しない (Fig 2A)。
- (B) 混合型 (KIT): SCF (stem cell factor) 二量体が KIT の D1-D3 ドメインを架橋すると同時に、膜近傍の D4 および D5 ドメイン間で受容体同士の直接的な同種相互作用 (homotypic interaction) が形成され、活性化に必要な配向が固定される (Fig 2B)。病的変異は D5 ドメインに集中し、リガンド不要の二量体化を誘導する。
- (C) 多成分複合体型 (FGFR): 単量体である FGF リガンド、FGFR の D2-D3 ドメイン、および副因子であるヘパリン (heparin) またはヘパラン硫酸プロテオグリカンが 2:2:2 の化学量論比で複合体を形成し、受容体の D2 ドメイン同士の直接接触も寄与して安定化する (Fig 2C)。
- (D) 完全受容体主導型 (EGFR/ErbB ファミリー): リガンド (EGF) は二量体界面に直接寄与しない。リガンドが同一受容体分子内のドメイン I および III に同時結合することで、ドメイン II に隠されていた「二量体化アーム (dimerization arm)」が露出し、受容体同士の直接接触によって二量体が形成される (Fig 2D)。
細胞内キナーゼドメインにおける自己抑制の 4 系統: RTK の TKD は、リガンド非存在下において cis な分子内相互作用によって活性が抑制されており、二量体化に伴う相互トランスリン酸化 (trans-phosphorylation) によってこの抑制が解除される。自己抑制の機構は以下の 4 系統に分類される。
- (A) 活性化ループ阻害型 (InsR / IGF1R / FGFR1): 不活性状態では、活性化ループ内の特定のチロシン残基 (InsR の Y1162 など) が活性部位に侵入し、ATP や基質タンパク質のアクセスを物理的に遮断している (Fig 2E)。トランスリン酸化によりループが排除され、触媒効率が約 50倍 から 200倍 上昇する。
- (B) 近膜領域阻害型 (KIT / Flt3 / Eph ファミリー): JM 領域が TKD の αC ヘリックスや活性化ループと結合して不活性型コンフォメーションを安定化させている。JM 領域内のチロシン残基がトランスリン酸化されることで、この自己抑制が解除される。
- (C) C 末端テール阻害型 (Tie2): C 末端テールがキナーゼの活性部位やヌクレオチド結合ループを遮断しており、自己リン酸化によって排除される。
- (D) アロステリック活性化型 (EGFR/ErbB ファミリー): 活性化ループのリン酸化を必要としない独自の機構を持つ。
EGFR における非対称二量体形成によるアロステリック活性化: EGFR の TKD 活性化は、活性化ループのリン酸化を必要とせず、サイクリン依存性キナーゼ (CDK) がサイクリンによって活性化される機構に類似した「非対称二量体 (asymmetric dimer)」の形成によって達成されることが Zhang et al. Cell 2006 により解明された (Fig 2F)。二量体中の一方のキナーゼドメイン (Activator) の C-lobe が、他方のキナーゼドメイン (Receiver) の N-lobe に直接接触し、Receiver の αC ヘリックスを活性型コンフォメーションへと押し込む。このアロステリック効果により、Receiver はリン酸化なしで活性化される。 この機構は、触媒活性を欠損した擬似キナーゼである ErbB3 が、ErbB2 や EGFR とヘテロ二量体を形成した際に Activator として機能し、強力な下流シグナルを駆動できる理由を合理的に説明する。また、NSCLC で頻出する EGFR L858R 変異 (活性化ループ内のロイシンからアルギニンへの置換) は、不活性状態の疎水性コアを不安定化させることで、Receiver としての活性型コンフォメーションをとりやすくし、リガンド非依存的な恒常性活性化を引き起こす (Fig 2F)。
マルチドメイン相互作用によるシグナル複合体形成とボウタイ構造: 活性化された RTK の自己リン酸化チロシン残基は、SH2 (Src homology 2) ドメインや PTB (phosphotyrosine-binding) ドメインを有する下流のシグナル伝達因子のドッキングサイトとなる。これらの因子は、単一のドメイン結合だけでなく、複数のドメイン (PH, C2, SH3 ドメインなど) を介したマルチバレントな相互作用によって細胞膜上に集積し、シグナル複合体を形成する (Fig 3)。例えば、PLC-γ (phospholipase Cγ) は 2 つの SH2 ドメイン、2 つの PH ドメイン、1 つの C2 ドメイン、および 1 つの SH3 ドメインを協調的に用いて膜上に局在化し、シグナル入力を統合する「コインシデンス検出 (coincidence detection)」を行う (Fig 3B)。特に PLCγ1 の N末端 SH2 ドメインは、リン酸化された FGFR1 細胞内領域に対して KD 33 nM という極めて高い親和性で結合し、これは通常の短ペプチドに対する親和性 (KD > 1 uM) と比較して 15-fold 以上の強度を示す。 RTK シグナルネットワークは、多様な入力 (各種 RTK とリガンド) が、限定された少数のコアプロセス (RAS-MAPK 経路、PI3K-AKT 経路、PLC-γ 経路、JAK-STAT 経路) に収束し、再び多様な出力 (転写応答、細胞骨格制御) へと拡散する「ボウタイ (bow-tie) 構造」または「砂時計構造」を形成している (Fig 4B)。
シグナルダイナミクスを制御する正負のフィードバックループ: RTK ネットワーク内には、シグナルの振幅と持続時間を厳密に制御する多数のフィードバックループが存在する (Fig 4A)。
- 正のフィードバック: EGFR 活性化に伴う活性酸素種 (ROS, reactive oxygen species) の産生は、チロシンホスファターゼ (PTP) の活性中心のシステイン残基を一時的に酸化して不活性化し、受容体のリン酸化状態を維持・増幅する。また、Gab1 (Grb2-associated binder 1) が PI3K 活性化によって産生された PtdIns(3,4,5)P3 に自身の PH ドメインを介して結合することで、PI3K-AKT シグナルをさらに増幅するループが形成される (Fig 3A)。
- 負のフィードバック: 活性化された ERK (MAPK) は、上流の Sos を直接リン酸化して Grb2 との結合を阻害し、RAS 活性化を抑制する。また、ERK は EGFR の近膜領域の T669 残基をリン酸化して受容体の活性を減衰させる。さらに、Cbl などの E3 ユビキチンリガーゼが活性化受容体に結合してポリユビキチン化を誘導し、リソソームでの受容体分解 (downregulation) を促進する。
臨床における病的変異と分子標的薬に対する耐性獲得機構: RTK の病的変異は、がんの主要なドライバーである。臨床において、EGFR 阻害薬 (ゲフィチニブやエルロチニブ) に対する耐性は、ゲートキーパー変異である T790M の二次変異によって生じる。T790M 変異は、ATP 結合ポケット内のスレオニンが嵩高いメチオニンに置換されることで、阻害薬の結合を立体的に阻害すると同時に、ATP に対する親和性を野生型と同等以上に高めることで薬効を消失させる。 また、Engelman et al. Science 2007 が示したように、MET 遺伝子の増幅は、ErbB3 を特異的に活性化して PI3K-AKT 経路をバイパス駆動することにより、EGFR 阻害薬に対する耐性を誘導する。このようなネットワークレベルの適応は、単一の RTK 阻害に対する限界を示しており、複数ノードの同時阻害や下流コアプロセス (PI3K など) を標的とした治療設計の必要性を裏付けている。
考察/結論
先行研究との違い: 本総説は、Ullrich & Schlessinger 1990 などの古典的な「単一のリガンド結合による単純な二量体化と活性化」モデルと異なり、近年の X 線結晶構造解析の進展によって明らかになった細胞外領域の二量体化における 4 つの多様なモード (TrkA, KIT, FGFR, EGFR) を体系的に分類・整理した点で、従来の画一的な理解と大きく異なる。さらに、キナーゼドメインの活性化において、従来の「活性化ループのトランスリン酸化が必須である」というドグマに対し、EGFR/ErbB ファミリーが示すリン酸化非依存的な非対称二量体形成によるアロステリック活性化機構を明確に対比させ、RTK 活性化の多様な制御戦略を 1 つの統合的フレームワークとして提示した点が、単一の受容体のみを扱った個別論文や従来の線形シグナル伝達を記述した総説と対照的である。
新規性: 本研究の新規性は、構造生物学的な超微細構造 (原子レベルでのキナーゼドメインの自己抑制と解除機構) から、細胞レベルでのシグナルダイナミクス (ボウタイ構造、正負のフィードバックループ)、さらには臨床医学における病的変異 (EGFR L858R, T790M, KIT 変異など) と分子標的治療薬に対する耐性獲得機構に至るまでを、一貫した因果関係のチェーンとして初めて統合的に論じた点にある。特に、Zhang et al. Cell 2006 や Sharma et al. NatRevCancer 2007 などの個別の知見を、システム生物学的なロバストネス (robustness) の概念と結びつけ、なぜ単一の標的阻害が耐性を招くのかを構造-ネットワークの相関から理論的に説明した点は、これまで報告されていない新規な概念的統合である。
臨床応用: 本総説に提示された学術的知見は、がん治療における bench-to-bedside の橋渡しに直結する極めて重要な臨床的含意を持つ。第一に、EGFR のアロステリック活性化機構および T790M 耐性変異の構造的理解は、第3世代の不可逆的 EGFR-TKI (オシメルチニブなど) や、C797S 変異に対処するための第4世代アロステリック阻害薬の合理的な創薬設計 (rational drug design) を直接的に導く。第二に、ErbB3 が触媒活性を欠損しつつも強力な Activator として機能するというヘテロ二量体化の分子メカニズムは、HER2 陽性乳がんにおけるトラスツズマブとペルツズマブの併用療法の臨床的有用性を強固に支持する。第三に、MET 増幅によるバイパス耐性経路の同定は、臨床現場における EGFR 阻害薬と MET 阻害薬の併用療法の必要性を理論的に裏付けている。
残された課題: 本総説が執筆された 2010 年時点における今後の検討課題および limitation として、以下の点が挙げられる。第一に、生細胞 (live cell) の膜環境における RTK の動的な 1 分子解析や、高次オリゴマー形成の定量的な評価技術が未だ発展途上であり、結晶構造から得られた静的な二量体モデルが実際の細胞膜上でどのように揺らいでいるのかという動的ダイナミクスが十分に解明されていない。第二に、脂質二重層の組成 (コレステロールや特定のリン脂質) や膜の物理的特性が RTK の活性化閾値に与える影響が未確立である。第三に、システム生物学的アプローチにおいて、シグナルネットワークを構成する数百の反応パラメータの定量的実測値が不足しており、完全な数理予測モデルの構築には至っていない。今後の研究方向性として、クライオ電子顕微鏡 (cryo-EM) 技術を用いた全長の無傷 (intact) 受容体複合体の構造解明や、生細胞リアルタイムイメージング、および AI を用いたシグナルネットワークの定量的シミュレーションが期待される。
結論: 本総説は、ヒト 58 種の RTK における細胞外二量体化の多様なモードと、細胞内キナーゼドメインの自己抑制・活性化機構を構造生物学的に整理した。特に EGFR における非対称二量体によるアロステリック活性化機構は、従来のリン酸化必須モデルに対する重要な例外であり、がんにおける活性化変異や薬剤感受性を理解する上での必須の基盤である。RTK シグナルは高度に複雑なボウタイネットワークを形成しており、その動的な正負のフィードバック制御を定量的かつ空間的に理解することが、今後の分子標的薬開発および耐性克服に向けた不可欠なマイルストーンとなる。
方法
本論文は、特定の新規実験データを提供する原著論文ではなく、構造生物学、生物物理学、細胞生物学、システム生物学、および臨床腫瘍学の広範な文献を横断的に統合した包括的ナラティブレビュー (narrative review) である。そのため、明示的な臨床試験登録番号 (NCT 番号など) や特定の統計解析手法 (Cox regression や log-rank 検定など) は直接適用されない。
しかし、本総説における知見の統合にあたっては、主要な学術データベース (PubMed, Web of Science, Cell Press archives) から厳選された数百報の一次文献が精査されている。特に、構造生物学的解析の基盤として、PDB (Protein Data Bank) に登録された多様な RTK 細胞外領域および細胞内キナーゼドメインの X 線結晶構造データが比較検討された。対象となった代表的な細胞株や受容体システムには、EGFR/ErbB ファミリー、Insulin 受容体、IGF1R (insulin-like growth factor 1 receptor)、FGFR1/2/3、KIT (stem cell factor receptor)、PDGFR、VEGFR、TrkA (tropomyosin receptor kinase A)、Eph (erythropoietin-producing hepatocellular receptor)、Tie2 (tyrosine kinase with immunoglobulin-like and EGF-like domains 2)、Ret、MuSK (muscle-specific kinase)、DDR1 (discoidin domain receptor 1)/DDR2 などが含まれる。
また、システム生物学的なシグナルネットワークの解析においては、PC12 細胞 (ラット副腎褐色細胞腫由来細胞株) における EGF 刺激 (一過性 ERK 活性化・増殖) と NGF (nerve growth factor) 刺激 (持続性 ERK 活性化・分化) のダイナミクスを比較した定量的プロテオミクスおよび数理モデルの文献データを統合している。さらに、臨床データとして、NSCLC 患者由来の EGFR 変異体 (L858R, exon 19 deletion, T790M) を発現させた H1299 や A549 などの肺がん細胞株における薬剤感受性データ、および GIST (gastrointestinal stromal tumor) 患者における KIT 変異 (exon 11 や exon 17 変異) に対するイマチニブ (imatinib) の阻害活性 (IC50 値) などの薬理学的指標を構造モデル上にマッピングし、分子構造と臨床応答の相関性を解析した。