- 著者: Daniel W Lee, James N Kochenderfer, Maryalice Stetler-Stevenson, Yongzhi K Cui, Cindy Delbrook, Steven A Feldman, Terry J Fry, Rimas Orentas, Marianna Sabatino, Nirali N Shah, Seth M Steinberg, Dave Stroncek, Nick Tschernia, Constance Yuan, Hua Zhang, Ling Zhang, Steven A Rosenberg, Alan S Wayne, Crystal L Mackall
- Corresponding author: Daniel W Lee / Crystal L Mackall (Pediatric Oncology Branch, National Cancer Institute, Bethesda, MD, USA; mackallc@mail.nih.gov)
- 雑誌: The Lancet
- 発行年: 2015
- Epub日: 2014-10-13
- Article種別: Original Article
- PMID: 25319501
背景
B細胞前駆急性リンパ芽球性白血病 (B-ALL) は小児で最も一般的な悪性腫瘍であり、新規診断例では約90%の生存率が達成されているものの、長期的な治療毒性が依然として大きな課題である。特に、再発・難治性B-ALLの予後は極めて不良であり、従来の救援化学療法ではクロファラビンを用いた場合でも奏効率は8〜20%に留まり、過去10年間で治療成績の顕著な改善は見られなかった。化学療法抵抗性を示す症例では、最終的な寛解が得られなければ生存率は10%未満と報告されており、この集団に対する新たな治療戦略の確立が強く求められていた。この分野において、既存の治療法では十分な効果が得られないという課題が残されていた。
キメラ抗原受容体 (CAR) T細胞療法は、モノクローナル抗体の抗原認識配列 (scFv) とT細胞活性化シグナルドメインを組み合わせた人工受容体をT細胞に導入することで、腫瘍選択的な殺傷能を付与する革新的なアプローチである。CD19はB細胞系腫瘍に普遍的に発現する一方で、正常B細胞にも発現するが、CD19欠損によるB細胞形成不全は免疫グロブリン補充療法で補償可能であるため、CAR-T細胞療法の標的として適していると考えられていた。これまで、少数症例報告や小規模シリーズにおいて、B細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、およびB-ALLにおけるCD19-CAR-T細胞の抗腫瘍効果が報告されていた。例えば、Porter et al. NEnglJMed 2011やBrentjens et al. Blood 2011は、それぞれ慢性リンパ性白血病とB細胞性白血病におけるCAR-T細胞の安全性と持続性を示した。また、Kochenderfer et al. Blood 2012は、B細胞枯渇とサイトカイン関連毒性を伴う奏効を報告している。しかし、均一な治療レジメンで順次登録された患者全例を対象とした、厳密なintention-to-treat解析に基づく安全性、実行可能性、および奏効率の包括的な評価は未解明であった。
CAR-T細胞の共刺激ドメインとして、CD28と4-1BBのどちらを選択するかについては議論が続いていた。ペンシルベニア大学グループのCTL019 (4-1BBベース) では、長期的なCAR-T細胞の体内残存が報告されていた（Porter et al. NEnglJMed 2011、Grupp et al. NEnglJMed 2013）。一方、本試験で採用されたCD28ベースのCARは、より短期的な残存が予測されていたが、同種造血幹細胞移植 (HSCT) への橋渡しという臨床的文脈においては、短期で強力な奏効が求められるため、その特性が有利に働く可能性があった。さらに、CAR-T細胞療法に特有の重篤な有害事象であるサイトカイン放出症候群 (CRS) の効果的な管理体系の確立も、本試験の重要な目標の一つであった。従来の化学療法では改善が見られなかった再発・難治性B-ALL患者に対する治療選択肢が不足しており、CAR-T細胞療法の臨床的有用性を大規模かつ厳密なプロトコルで評価する必要があった。
目的
本研究の主要な目的は、再発・難治性B細胞性急性リンパ芽球性白血病 (B-ALL) およびB細胞性非ホジキンリンパ腫 (B-NHL) の小児・若年成人患者 (1〜30歳) を対象とした第1相用量漸増試験において、CD28共刺激ドメインを含むCD19キメラ抗原受容体 (CAR) T細胞 (MSGV-FMC63-28Z) の最大耐用量 (MTD) を決定することであった。MSGV-FMC63-28Zは、CD19を標的とするFMC63抗体由来の単鎖可変フラグメント (scFv) と、T細胞活性化シグナルを伝達するCD28共刺激ドメインおよびCD3ζ鎖を組み合わせたCAR構造である。副次的な目的として、本療法の安全性プロファイル、製造実行可能性、および抗白血病活性を評価することを目指した。具体的には、CAR-T細胞の製造成功率、有害事象の発生頻度と重症度、および奏効率を詳細に解析した。さらに、奏効および毒性に関連する生物学的相関因子を同定することも目的とした。これには、CAR-T細胞の体内動態 (末梢血、骨髄、髄液における増殖と持続性)、炎症性サイトカイン (IL-6、IFN-γ、TNFα、GM-CSF、IL-2、IL-10) の変動、および治療前の腫瘍量と、臨床転帰との関係性を詳細に解析することが含まれた。これにより、CD19-CAR-T細胞療法の効果と安全性を最大化するための知見を得ることを意図した。
結果
CAR-T細胞製造の実行可能性とMTD: 21名の登録患者のうち、19名 (90%、95% CI 69.6〜98.8%) でプロトコル規定のCD19-CAR-T細胞用量が成功裏に製造され、輸注された。これは高い製造実行可能性を示す。2名の患者では必要細胞数が製造できなかったが、製造された全量が投与され、毒性および有効性が評価された。患者2はクロファラビン後の重度リンパ球減少のため必要量の3%のみ、患者5は16%のみの製造であった。患者8を除く全ての患者に新鮮なCAR-T細胞がday 0に輸注された。用量レベル2 (3×10⁶ CAR-T細胞/kg) の4例中2例 (非HSCT群でGrade 4 CRS 1例、HSCT後群でGrade 3 CRS 1例) にDLTが発生したため、全コホートの最大耐用量 (MTD) は1×10⁶ CAR-T細胞/kgと決定された。その後のMTD拡大コホート (患者11〜21) では、さらに4例でGrade 3または4のCRSが発生したが、全ての毒性は可逆的であった。
B-ALLにおける抗腫瘍活性: B-ALL患者20例における主要有効性解析では、完全奏効率 (CR) は70% (14/20例、95% CI 45.7〜88.1%) であった。このうち、微小残存病変 (MRD) 陰性CRを達成したのは12例 (60%、95% CI 36.1〜80.9%) であった (Figure 1A)。特に、初回治療からMRD陰性を達成したことのない原発難治性の6例では、全例 (100%) でCRが達成された。同種HSCT後再発例においても、CR達成率は43% (3/7例) と、従来の救援化学療法と比較して良好な成績を示した。全21例 (びまん性大細胞型B細胞リンパ腫患者1例を含む) のintention-to-treat解析におけるCR率は66.7% (14/21例、95% CI 43.0〜85.4%) であった。
生存転帰: 全21例の中央追跡期間10か月における全生存期間 (OS) は、9.7か月以降で51.6%であった (Figure 1D)。MRD陰性CRを達成した12例の無白血病生存期間 (LFS) は、4.8か月以降で78.8%と良好に維持された。MRD陰性CR達成後に同種HSCTを施行した10例は、中央移植後追跡期間中央値10か月において全例が無病生存を維持していた。一方、HSCTが施行できなかった2例 (患者8、14) は、それぞれ3か月後と5か月後にCD19陰性白血病として再発した。3例 (患者1、7、14) には2回目のCD19-CAR-T細胞投与が実施されたが、客観的な奏効は認められなかった。
サイトカイン放出症候群 (CRS) とバイオマーカー: 全グレードのCRSは21例中16例 (76%) で発症した。発症中央値はday 4 (範囲1〜7日)、持続期間中央値は4.8日 (範囲1〜9日) であった。Grade 1が7例、Grade 2が3例、Grade 3が3例 (14.3%)、Grade 4が3例 (14.3%、95% CI 3.0〜36.3%) であった。CRSの管理は、支持療法のみが12例、トシリズマブ (抗IL-6R抗体) 追加が2例、トシリズマブとコルチコステロイド併用が2例 (Grade 4症例) であった。患者14はday 7にGrade 4 CRSに伴う心停止を来したが、蘇生後完全に回復した。CRS重症度と血漿中のIL-6、IFN-γ、CRPの上昇には有意な相関が認められた。Grade 3/4 CRS患者では、Grade 1/2以下の患者と比較してIL-6の変化倍率が有意に高値であった (Hodges-Lehmann推定差 434.2、95% CI 85.3〜1,127.3、p=0.0002)。IFN-γも同様に有意な上昇を示した (1,367.8、95% CI 226.7〜2,195.5、p=0.0002)。ピークCRP濃度もCRS重症度と有意に相関し (Hodges-Lehmann差 141.7、p=0.0015)、IL-6とCRPの間には強い相関関係が認められた (Spearman r=0.81、95% CI 0.54〜0.92、p<0.0001) (Figure 3D, E)。
神経毒性: 可逆的な神経毒性が6例で認められた。内訳はGrade 1の幻視が5例、Grade 3の一過性失語症が1例であった。神経毒性を発症した全例でCSF中からCD19-CAR-T細胞が検出され、神経毒性ありの患者では神経毒性なしの患者と比較して有意に高いCSF CAR-T細胞数が認められた (p=0.0039) (Figure 1B)。1例で可逆性脾部病変を伴う軽度脳症様のMRI変化が認められたが、2週間以内に消失した。
CAR-T細胞の体内動態と奏効・毒性との相関: 21例中18例 (86%) で末梢血中のCAR-T細胞増殖が確認され、フローサイトメトリーおよびqPCRの両方でday 14頃にピーク増殖を示した (day 7でSpearman r=0.79、day 14でr=0.89) (Figure 1F)。奏効患者は非奏効患者よりも有意に高いピークCAR-T細胞数を示し (フローサイトメトリーでp=0.0042、qPCRでp=0.0028)、ピークCAR-T細胞数とCRS重症度も有意に相関した (p=0.00011) (Figure 2C)。また、治療前の腫瘍量が多いB-ALL患者では、重症CRSのリスクが有意に高かった (p=0.039) (Figure 2E)。Grade 3または4のCRSを発症した患者では、CD8+ CAR+ T細胞、CD8+エフェクターメモリーCAR+ T細胞、およびCD4+エフェクターメモリーCAR+ T細胞の循環絶対数が有意に高値であった (それぞれp=0.0087、p=0.0087、p=0.026) (Figure 2D)。
末梢B細胞動態: 奏効した14例中12例で、day 14〜28に循環B細胞が検出感度以下に低下した。しかし、day 28以降に骨髄で正常B細胞前駆体 (haematogones) の出現が13例で確認され、早期のB細胞回復が示唆された (Figure 1C)。この所見は、4-1BBベースのCAR-T細胞療法で報告されている長期的なB細胞形成不全とは対照的であり、CD28ベースCARの短期残存と早期B細胞回復という特性を示唆する。
CSF中の抗白血病効果とCD19陰性再発: 髄液検体が得られたB-ALL患者17例中11例 (65%) でCSF中からCD19-CAR-T細胞が検出された (中央値2,790細胞、IQR 0〜23,715)。CNS白血病を有していた2例では、CAR-T細胞のCSF移行と同期してCSF白血病の消失が確認され、CAR-T細胞によるCNS白血病根絶の初の証拠が示された (Figure 1E)。奏効後に再発した2例 (患者7、14) では、CD19陰性白血病として再発した。非奏効例ではCD19抗原の喪失は認められなかった。
考察/結論
本試験は、化学療法抵抗性の小児・若年成人B-ALL患者を対象としたCD19-CAR-T細胞療法の第1相意図的治療解析として、重要な知見を複数提示した。まず、90%という高い製造実行可能性を示し、再発・難治性B-ALL患者において、CR率70%、MRD陰性CR率60%という、従来の治療法を大幅に上回る強力な抗腫瘍活性を達成した。特に、原発難治性の6例全てでCRを達成したことは、本療法の有効性を強く裏付けるものである。また、MRD陰性CRを達成した患者の多くが同種HSCTへの橋渡しを受け、10例全てが無病生存を維持していることから、CAR-T細胞療法がHSCT前の効果的なブリッジング戦略として確立される可能性が示された。全ての毒性は可逆的であり、管理可能であったことも重要な点である。
先行研究との違い: これまでの4-1BBベースのCAR-T細胞療法（Grupp et al. NEnglJMed 2013）では長期的なCAR-T細胞の体内残存が報告されていたのと異なり、本試験で用いたCD28ベースのCARは短期的な残存 (day 68以降ほぼ消失) であった。しかし、この短期残存にもかかわらず強力な抗腫瘍効果を発揮し、さらに早期のB細胞回復が認められ、重症B細胞形成不全を回避できるという利点が示されたことは新規の知見である。Davila et al. SciTranslMed 2014の成人ALL試験と比較しても、本試験は厳密なintention-to-treat解析と均一なプロトコルに基づいている点で高い内部妥当性を有する。クロファラビンによる小児ALLのCR率8〜20%と比較して、本試験の70%というCR率は顕著に優れており、従来の治療法では奏効が困難であった患者群に対する新たな治療選択肢となることを示唆する。
新規性: 本研究で初めて、CD19-CAR-T細胞が中枢神経系 (CNS) に浸潤し、CNS白血病を根絶できることを示した。これは、従来のCNS白血病治療における重大な課題に対する新規な治療アプローチとなる可能性を秘めている。また、サイトカイン放出症候群 (CRS) の重症度が、血漿中IL-6、IFN-γ、およびCRPのピーク濃度と強く相関することを示し、CRPがCRS重症度の予測バイオマーカーとなりうる可能性を新規に提示した。
臨床応用: 本研究はCRSの管理体系確立に大きく貢献した。Mackall grading、トシリズマブの先行使用、およびコルチコステロイドの追加という管理アルゴリズムが提案され、これはその後のCAR-T細胞試験における国際標準管理体系の基盤となった。この知見は、CAR-T細胞療法の臨床現場での安全性向上に直結する。本試験のデータは、Grupp et al. NEnglJMed 2013の報告とともに、ELIANA試験 (tisagenlecleucel、4-1BBベース) の第II/III相試験への道筋を開き、2017年のtisagenlecleucelのFDA初承認 (最初のCAR-T細胞療法承認) の学術的基盤を提供した。CAR-T細胞療法をHSCT前の橋渡し治療として位置づけることで、移植後の長期無病生存という新たな治療パラダイムを提示したことも重要な臨床的意義である。
残された課題: 今後の検討課題としては、CD19陰性再発への対策が挙げられる。本試験でCD19陰性再発が2例に認められたことから、CD22 CARや二重特異的CARの設計など、抗原喪失による治療抵抗性を克服する戦略が今後の重要な研究方向性である。また、長期的な毒性、特に神経毒性やB細胞形成不全の評価、CAR-T細胞の残存性と維持治療の要否、大規模製造コストの低減、およびHSCT適格外患者や他の疾患への適応拡大も今後の重要な研究方向性として残されている。本研究は単施設試験であり、限られた患者数での評価であるため、より大規模な多施設共同試験での検証が望まれるというlimitationも存在する。
方法
試験デザインと患者選択: 本研究は、国立癌研究所 (NCI) 小児腫瘍科で実施された、非盲検単施設第1相3+3用量漸増試験 (ClinicalTrials.gov登録番号: NCT01593696) である。2012年7月2日から2014年6月20日までに患者が登録された。対象患者は1〜30歳で、CD19陽性B-ALL (主) またはB細胞性非ホジキンリンパ腫 (B-NHL) の診断を受け、標準療法および1レジメン以上の救援化学療法後に再発または難治性となった症例であった。測定可能な疾患、良好なパフォーマンスステータス、および十分な臓器機能を有することが適格基準に含まれた。中枢神経系 (CNS) 白血病については、CNS1 (髄液白血病陰性) またはCNS2 (神経症状なしで髄液中に芽球を認める) の患者を適格とし、CNS3または孤立性髄外白血病は除外された。同種造血幹細胞移植 (HSCT) 既往患者は、移植後100日以上経過し、移植片対宿主病 (GVHD) の徴候がなく、免疫抑制剤を必要としない場合に適格とされた。プロトコルおよびその修正はNCIの施設内審査委員会によって承認され、患者またはその保護者から文書によるインフォームドコンセントを得た。
CAR構造と製造: CAR-T細胞は、FMC63抗CD19 scFv、CD28膜貫通・共刺激ドメイン、およびCD3ζ鎖を含むMSGV-FMC63-28Zレトロウイルスベクターを用いて作製された。白血球アフェレーシスから11日間でGMP基準に準拠した製造が行われた。細胞製品のリリース基準には、生存率、無菌性、CAR導入率、および複製能を有するレトロウイルスの陰性 (PCR法) が含まれた。平均CAR導入効率は66.0% (95% CI 55.1〜76.8%) であった。
用量設定と前処置: 用量漸増は標準的な3+3デザインを採用した。用量レベル1 (Dose 1) は1×10⁶ CAR-T細胞/kg (±20%)、用量レベル2 (Dose 2) は3×10⁶ CAR-T細胞/kg (±20%) と設定された。必要細胞数が製造できない場合は、製造された全量を投与し、毒性および有効性は評価されたが、MTD決定には算入されなかった。患者はCAR-T細胞輸注に先立ち、フルダラビン (25 mg/m²を3日間: day -4〜-2) とシクロホスファミド (900 mg/m²を1日: day -2) によるリンパ球除去化学療法を受けた。CAR-T細胞はday 0に単回点滴静注された (30分間)。
評価項目: 主要評価項目は、CD19-CAR-T細胞のMTD、レジメンの毒性プロファイル、およびCAR-T細胞製造の実行可能性であった。副次評価項目には、奏効率 (day 28評価、RECIST v1.1/Cheson基準)、微小残存病変 (MRD) 陰性率 (フローサイトメトリーで<0.01%の骨髄芽球)、末梢血・骨髄・髄液 (CSF) におけるCAR-T細胞の体内動態 (フローサイトメトリーおよびqPCR)、および炎症性サイトカイン (IL-6、IFN-γ、TNFα、GM-CSF、IL-2、IL-10をMesoScaleDiscovery multiplexアッセイで測定) の評価が含まれた。毒性はNCI Common Terminology Criteria for Adverse Events v4.02に基づき評価されたが、サイトカイン放出症候群 (CRS) は改訂された独自の評価システムが用いられた。非血液学的用量制限毒性 (DLT) は、治療レジメンと関連がある可能性のある、CAR-T細胞輸注後28日以内に発生したグレード3以上の毒性と定義された。血液学的DLTは、基礎疾患に起因しない、30日以上持続するグレード4の毒性 (リンパ球減少を除く) とされた。
統計解析: 全21名の登録患者が解析に含まれた。CAR-T細胞製品が規定用量を満たさなかった2名の患者は、実行可能性と奏効の評価には含まれたが、毒性評価に基づく用量漸増には算入されなかった。全生存期間 (OS) および無白血病生存期間 (LFS) の確率は、Kaplan-Meier法を用いて推定された。OSは全登録患者を対象とし、LFSはMRD陰性奏効を達成した患者を対象とした。その他の統計解析には、Spearmanの順位相関係数、Hodges-Lehmann推定差などが用いられた。