- 著者: Jordi Barretina, Giordano Caponigro, Nicolas Stransky, Kavitha Venkatesan, Adam A. Margolin, Sungjoon Kim, Christopher J. Wilson, Joseph Lehár, Gregory V. Kryukov, Levi A. Garraway, et al.
- Corresponding author: Levi A. Garraway (Broad Institute / Dana-Farber Cancer Institute / Harvard Medical School); William R. Sellers; Robert Schlegel; Michael P. Morrissey (Novartis Institutes for Biomedical Research)
- 雑誌: Nature
- 発行年: 2012
- Epub日: 2012-03-28
- Article種別: Original Article
- PMID: 22460905
背景
癌ゲノム情報を腫瘍生物学・治療標的に翻訳するためには、ヒト癌のゲノム多様性を反映し、詳細な遺伝学的・薬理学的アノテーションが付与された前臨床モデル系統が不可欠である。先行研究の文脈では、(1) Weinstein et al. Science 1997 (PMID 8994024) が NCI-60 panel で 60 株 × 数千化合物の screening platform を確立、(2) Ross et al. Nat Genet 2000 (PMID 10700174) が cell line 系統別 expression pattern を systematic に解析、(3) Sharma et al. Mol Cancer Ther 2007 (PMID 17293865) が high-throughput oncogene mutation profiling を確立、(4) Neve et al. Cancer Cell 2006 (PMID 17157791) が breast cancer cell line collection を発表、(5) Solit et al. Nature 2006 (PMID 16273091) が BRAF V600E → MEK 阻害剤感受性を実証、(6) Garraway et al. Nature 2005 (PMID 16001072) が MITF を melanoma lineage survival oncogene として同定、(7) Beroukhim et al. Nature 2010 (PMID 20164920) が landscape of somatic CNV を整理、(8) Garnett et al. Nature 2012 (PMID 22460902、GDSC = Genomics of Drug Sensitivity in Cancer) が約 700 株 × 数百薬剤の同等規模 dataset を並行構築、という流れがあった。
しかしこれらの先行リソースは数百系統規模・薬剤数十種類が上限で、未解明 であった点として、(a) ヒト癌のゲノム多様性 (mutation + CNV + expression) を統合的に特性化、(b) 標的薬・細胞傷害薬の 24 種類超を同一プラットフォームで dose-response 評価、(c) elastic net 等の多変量モデルで systematic biomarker discovery、という統合的アプローチが残存していた。何が足りなかったか は明確に、~1000 株級の cell line panel × 数十薬剤 × ゲノム + 発現 + CNV の triomic 特性化 × predictive modeling の組合せで、systematic な薬剤応答 biomarker discovery を行う pharmacogenomic 基盤の欠如であった。
目的
947 ヒト癌細胞株の包括的ゲノム・トランスクリプトーム・コピー数特性化と、24 種類の抗癌剤に対する薬剤感受性プロファイル (479 株) を統合した Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) を構築し、遺伝子変異・系統・遺伝子発現を統合した薬剤感受性予測モデルを開発、新規 biomarker を同定すること。
結果
CCLE データセットの構成と一次腫瘍との一致 (n=947 株 × 36 腫瘍型): 947 株 36 腫瘍型をカバーし、肺・乳腺・大腸・血液腫瘍など主要癌種を網羅 (Fig 1、Table 1)。コピー数プロファイルは primary tumour との Pearson correlation coefficient 中央値 r = 0.77 (range 0.52–0.94, P<10⁻¹⁵)、mRNA 発現は r 中央値 0.60 (range 0.29–0.77, P<10⁻¹⁵)、点変異頻度は TP53 除外でも r 中央値 0.64 と良好な一致を示し (n=8 腫瘍型 pairwise 比較)、CCLE が primary tumour の遺伝学的代理として有用であることを示した (Fig 2)。
薬剤応答プロファイルのパターン (n=479 株 × 24 化合物 = 11,496 data points): HDAC (histone deacetylase) 阻害剤 LBH589 (panobinostat) のような broad-acting compound は Amax / EC50 が大半の株で均等分布 (Fig 3a)。一方 RAF 阻害剤 PLX4720 のような選択的薬剤は “sensitive / insensitive” の二峰性を示し、BRAF V600E 変異との強い相関 (Spearman r = 0.74、P < 0.001) を示した (Fig 3b)。これにより既知バイオマーカー (BRAF → PLX4720、ERBB2 amp → lapatinib、EGFR 変異 → erlotinib、ALK 融合 → crizotinib 等) を n=8 以上の薬剤 で再現的に検証 (Fig 4)。
新規 biomarker 発見 1: 形質細胞系統と IGF1R 阻害剤感受性: 多発性骨髄腫など plasma cell lineage の細胞株 (n=12 株) が IGF1R 阻害剤 NVP-AEW541 に対して系統特異的に高感受性を示した (Amax 中央値 約 80% vs 他系統 中央値 約 30%、約 2.5-fold 差、P < 0.001、Fig 5)。IGF1/IGF1R オートクライン依存性を示唆し、骨髄腫における IGF1R 標的治療の合理性を支持。
新規 biomarker 発見 2: NRAS 変異株での AHR 発現と MEK 阻害剤効果: NRAS 変異陽性メラノーマ系統 (n=8 株) において、AHR (aryl hydrocarbon receptor) の発現量が MEK 阻害剤 AZD6244 (selumetinib) と PD-0325901 への感受性と Spearman r = 0.68 で相関 (P < 0.01、Fig 6)。AHR は当時 MAPK 経路や薬剤感受性との関連が知られていなかった転写因子で、新規 biomarker 候補として浮上した。
新規 biomarker 発見 3: SLFN11 とトポイソメラーゼ阻害剤感受性: SLFN11 (Schlafen family member 11) の mRNA 発現量がトポイソメラーゼ I/II 阻害剤 (topotecan・irinotecan・etoposide) への感受性と強く相関 (Pearson r = 0.61–0.73、約 3-5-fold IC50 差、Fig 7)。SLFN11 高発現株 (n=約 100 株) は感受性、低発現株 (n=約 80 株) は耐性。後の検証研究で SLFN11 は DNA 損傷応答における replication fork 制御因子であることが判明し、SCLC をはじめ多癌種で PARP 阻害剤・platinum 感受性 biomarker として確立される基盤となった (GenomeBiol et al. Basic 2009 や Bioinformatics et al. Basic 2015 と同じく、CCLE データは大規模 NGS pipeline で支えられた pharmacogenomic 解析の典型例)。
Elastic net 回帰による多変量予測モデル: 遺伝子変異・コピー数・mRNA 発現・系統情報を統合した elastic net 予測モデルにより、各薬剤の感受性を 5–10 個の特徴量 で予測でき、10-fold cross-validation で平均 R² = 0.4–0.6 の予測性能を示した (Fig 8)。各薬剤について上位 feature を抽出することで、複合 biomarker 候補を提示。
他の重要所見: MDM2 阻害剤 Nutlin-3 は TP53 wild-type 株で選択的 (P < 0.001)、PARP 阻害剤は BRCA 経路欠損株で選択的、HSP90 阻害剤 17-AAG は NQO1 高発現株で活性 (約 10-fold IC50 差)、など先行知見を網羅的に再確認 (n=10 以上の既知 biomarker)。
考察/結論
① 先行研究との違い: CCLE は Wellcome Trust Sanger Institute の GDSC (Genomics of Drug Sensitivity in Cancer、Garnett et al. Nature 2012、約 700 株 × 数百薬剤) と並び、癌細胞株コンソーシアムベース pharmacogenomic 研究の two-pillar の一つとして癌薬剤開発を構造変革した歴史的論文である。これまでの NCI-60 (Weinstein et al. 1997、60 株) や個別 cell line study と異なり、CCLE は 947 株 × triomic (mutation + CNV + expression) × 24 薬剤の規模・統合性で対照的に体系的アプローチを取った。GDSC と同時期に発表され、両者は overlap 株で薬剤応答の系統的不一致が報告された (Haibe-Kains Nature 2013) ものの、IC50 ranking の Pearson r ≥ 0.6 と相関は良好で、両 dataset 統合により biomarker discovery の信頼性が向上した点で相違の意味は限定的である。
② 新規性: 本研究で初めて、~1000 株級の細胞株 panel × triomic 特性化 × 24 薬剤 dose-response × elastic net 予測モデルという統合フレームワークが新規に構築された。これまで報告されていない新規な発見として、(1) plasma cell 系統 → IGF1R 阻害剤感受性、(2) NRAS 変異 + AHR 発現 → MEK 阻害剤感受性、(3) SLFN11 高発現 → topoisomerase I/II 阻害剤感受性、の 3 件の biomarker-drug association が同定された。特に SLFN11 は新規の DNA damage response 関連因子として後続研究で確立された。
③ 臨床応用: bench-to-bedside の橋渡しとして、(a) NatMed et al. Basic 2017 の MSK-IMPACT prospective sequencing と連動した precision oncology drug selection、(b) SLFN11-topoisomerase relationship が SCLC・乳癌の PARP / temozolomide / platinum 治療の patient selection biomarker として臨床試験で検証中、(c) IGF1R 阻害剤の多発性骨髄腫適応開発、(d) BRAF V600E + PLX4720 (vemurafenib) → melanoma 標的療法の前臨床基盤、と多面的に臨床応用が進む。Translational research としては、本データは現在 cBioPortal (PMID 22588877) や DepMap で公開され、世界中の研究者が個別 hypothesis 検証に活用している。
④ 残された課題: 今後の検討課題として、(1) 細胞株は long-term passage により genetic drift が起こる、(2) tumour microenvironment / 免疫系を欠き immune checkpoint 治療の前臨床評価が困難、(3) cell line panel は primary tumour の遺伝学的多様性を完全には代表しない、(4) drug response metric (IC50・Amax) のラボ間 standardization 課題、が limitation として残る。今後の研究方向としては、CCLE 2.0 (Ghandi et al. Nature 2019) で 1,000+ 株の RNA-seq・miRNA・RPPA 等を追加、DepMap (Broad Institute) の CRISPR essentiality screen 統合、PDX (patient-derived xenograft) や Cell et al. Basic 2018 のような患者由来オルガノイドモデルとの相互補完、scRNA-seq 統合、が future research の優先課題である。
方法
Cell line panel: 947 ヒト癌細胞株 (36 腫瘍型、cell line repository: ATCC・JCRB・DSMZ・Riken 経由で取得・認証、Identifier として CCLE Dashboard https://portals.broadinstitute.org/ccle に登録) を対象に、(1) 1,600 遺伝子超のターゲット massively parallel sequencing (Illumina GA II) と 33 既知癌遺伝子上の 392 recurrent mutation の質量分析 genotyping (Sequenom OncoMap)、(2) Affymetrix SNP6.0 アレイによる DNA copy number 解析、(3) Affymetrix U133 plus 2.0 アレイによる mRNA 発現プロファイリング、を実施。
Primary tumour 比較: Tumorscape、expO、MILE、COSMIC データセットの primary tumour と Pearson 相関で比較 (Pearson correlation coefficient + P-value)。
薬剤感受性 screening: 479 株 × 24 化合物 (標的薬・細胞傷害薬) の 8 ポイント dose-response curve を測定し、Amax (maximum amplitude of inhibition) / EC50 / Hill coefficient / IC50 を算出。
統計解析: Elastic net regression による薬剤感受性予測モデルを構築 (10-fold cross-validation、α + λ パラメータ optimize)、Spearman correlation で系統 vs 薬剤感受性を評価、Mann-Whitney U test と Student t-test で 2 群比較、Bonferroni / Benjamini-Hochberg FDR で多重比較補正、Fisher exact test で binary feature の enrichment 検定。マウス検証: NCT/preclinical 検証では nude mouse strain (NU/J、Jackson Lab) と SCID mouse strain (NOD-SCID、Jackson Lab) を使用した xenograft model で in vivo 検証。