- 著者: Petrini I, Meltzer PS, Kim IK, Lucchi M, Park KS, Fontanini G, Gao J, Zucali PA, Calabrese F, Favaretto A, Rea F, Rodriguez-Canales J, Walker RL, Pineda M, Zhu YJ, Lau C, Killian KJ, Bilke S, Voeller D, Dakshanamurthy S, Wang Y, Giaccone G
- Corresponding author: Giuseppe Giaccone (Lombardi Comprehensive Cancer Center, Georgetown University, Washington DC, USA)
- 雑誌: Nature Genetics
- 発行年: 2014
- Epub日: 2014-06-29
- Article種別: Original Article
- PMID: 24974848
背景
TET (thymic epithelial tumor、胸腺上皮腫瘍) は縦隔の最多原発性腫瘍であるが、世界的に10万人年あたり0.32と極めて希少な疾患である (deJong et al. EurJCancer 2008)。WHO 2004分類 (Travis et al. 2004) に基づき胸腺腫はA型・AB型 (type AB thymoma)・B1型・B2型・B3型 (type B3 thymoma) と胸腺癌に細分化され、組織型は独立した予後因子として機能する。A・AB型胸腺腫は10年OS 100%近くと予後良好である一方、胸腺癌は10年OS 50%と最も攻撃的な表現型を示し、外科切除が主要治療だが転移例では化学療法による腫瘍縮小が60-80%に認められるものの根治は期待できない (Kelly et al. JClinOncol 2011)。
遺伝子異常の観点では、KIT変異が胸腺癌の9-10%に散発的に報告され (Strobel et al. NEnglJMed 2004)、TP53変異の散発的同定も知られていたが、いずれも小規模シリーズに基づく知見であった。胸腺腫については、A型とAB型が他の組織型と生物学的に異なるという臨床観察があったにもかかわらず、その分子基盤は全く不明であった。NGS (next-generation sequencing、次世代シークエンシング) を用いた系統的なゲノム解析はTETでは実施されておらず、(1) 組織型別 driver mutation の包括的同定、(2) 胸腺腫と胸腺癌の分子的連続性 vs 独立性の解明、(3) 予後分子マーカーの発見、(4) 標的療法開発の基盤構築、の4点が明確に不足 (gap in knowledge) していた。GTF2I (General Transcription Factor II-I; chromosome 7q11.23) はTFII-I (Transcription Factor II-I) タンパク質をコードし、6つのhelix-loop-helix様I-repeatドメインを持つ多機能転写因子であるが、がん発症との関連はこれまで全く報告されていなかった。以上の未解決問題を背景に、本研究は大規模TET cohortに対する初めての系統的NGSゲノム解析として設計された。
目的
NGS技術を用いてTETの体細胞変異・コピー数異常を系統的に同定し、(1) 全TETの統合的mutation landscape構築、(2) WHO組織型別の特異的driver mutation同定、(3) 同定変異の274例検証コホートにおける頻度確認および予後相関の評価、(4) 同定変異の機能的検証 (in vitro proliferation assay)、を目的とした。
結果
変異数の組織型依存的差異：胸腺癌 43.5/例 vs 胸腺腫 18.4/例 (Fig 1a)
WES 28例のcoding regions に722 somatic SNVs (single nucleotide variants) + 68 indels を同定し、平均28変異/sample (range 3-94) であった。胸腺癌の平均変異数43.5/例は胸腺腫の18.4/例より有意に高く (Mann-Whitney U test p=0.001)、ゲノム不安定性が組織型の悪性度に比例することが示された (Fig 1a)。B3型胸腺腫はA型・B2型より変異数が多い傾向を示したが統計学的有意差には達しなかった。197-cancer gene custom panel (n=52例) とWESの結果は高度に一致し (χ² p<0.001)、two-platform concordanceが確認された (Fig 1b)。融合転写産物は25例中7例で同定され (known: TY82細胞株のBRD4-NUT)、GTF2I sequence に関わる融合は認められなかった。
GTF2I p.Leu404His 変異：A型胸腺腫82%の異常な高頻度 (Fig 2a)
21例の胸腺腫WESで recurrent变異を示した唯一の遺伝子はGTF2Iであり、chromosome 7 c.74146970T>A = protein-level p.Leu404His (B isoform) / p.Leu383His (D isoform) の missense変異が全変異例で同一ヌクレオチドを共有していた。この変異はdbSNP137・ESP5400・COSMICデータベースのいずれにも登録されていない novel somatic mutationであり、SIFT・PolyPhen-2の双方でdeleterious と予測された。変異はTFII-I protein の second conserved I-repeat domain 内のDNA binding site 近傍 (RILLAKE配列内のLeu) に位置し、Sanger sequencingで全変異例の正常DNA (末梢血) に変異が存在しないことを確認。pseudogenes (GTF2IP1, LOC10093631) には変異を認めなかった。
274例の validation cohortでGTF2I変異は119/270例 (43.4%) に検出され、WHO組織型別頻度: A型 45/55 (82%)・AB型 63/85 (74%)・B1型 8/33 (24%)・B2型 8/50 (16%)・B3型 1/15 (7%)・胸腺癌 3/36 (8%) と、低悪性度組織型で圧倒的に高く悪性度増加に伴い漸減する striking inverse pattern を示した (Fig 2a)。Stage I-II症例での変異頻度57%はStage III-IV症例の19%より有意に高く (χ² p<0.001)、Binomial logistic regression (WHO histotype + stage + completeness of resection) では histotype のみがGTF2I mutation status を有意に予測した (p<0.001)。
GTF2I 変異と劇的な予後改善：10年OS 96% vs 70% (Fig 2b)
204 evaluable patients (median follow-up 39.4 months、95% CI 30.3-48.5) を対象とした生存解析で、GTF2I MUT (n=83) は WT (n=121) に対して10年disease-related survival 96% vs 70%という劇的な予後差を示した (log-rank p<0.001、Fig 2b)。GTF2I MUT陽性の胸腺癌3例は全例観察期間中生存 (median follow-up 27.6 months、95% CI 0-70 months)。胸腺腫のみに限定した解析では MUT 96% vs WT 88% (log-rank p=0.057) とtrendを認めたが、有意差には達しなかった。Ki67染色: A型 (MUT 2% vs WT 3%) および B3型 (13% vs 11%) では差なし、胸腺癌はMUT 5% < WT 14% (3例、全例 KIT IHC (immunohistochemistry) 陽性)。多変量Cox解析ではGTF2I statusとWHO histotypeは相互依存的 (confounding)、stage・WHO・GTF2Iの3変数モデルではstageのみが独立予後因子であった。GTF2I陽性群でdisease progression死亡はわずか2/83例 (1例B3型、1例B2型) に対し、WT群では26/121例 (21%、p<0.0001)。
TFII-Iの機能的解析：Protein stabilizationによる増殖促進 (Fig 3)
RNA-seqによりGTF2I変異は全evaluated thymomas (5例A型+2例AB型) でmutation alleleとwild-type alleleの双方が発現し、mutation allele平均47% (range 44-49%) の heterozygous expression を示した (Fig 3a)。5種のGTF2I isoform (A, B, G, D, 5) の中でexon 10がsilentでexon 12がhalf-expressionであることから B・D isoform が主要 isoform と同定された (Kruskal-Wallis p<0.0001; Dunn’s post hoc p<0.0001 for both B and D)。
Western blot (n=21 frozen tumors、3 independent blots) ではMUT腫瘍でWT腫瘍よりTFII-I蛋白発現が高く (Fig 3b)、一方mRNA level (FPKM、WT n=7 vs MUT n=5) では差がなかった (Fig 3c)。Cycloheximide (100 μg/ml) でprotein synthesis阻害後の動態解析でMUT TFII-Iが WT より緩徐な分解を示し、protein stabilizationが機序と示唆された。これは、変異がRILLAKE配列内 (RXXL (Arg-X-X-Leu) destruction box motif) のLeuをHisに置換し、ubiquitin-mediated proteasomal degradation 機構による認識を障害する (Desgranges 2005、J Mol Cell Biol) という構造的仮説と一致する。
NIH-3T3 cells (ATCC) へのlentiviral ectopic発現実験 (各isoform 4 independent stable pools) では、MUT B・D isoform はWT counterpart より高いcell proliferation rate を示した (24-96 h、3 independent experiments、mean ± s.d.、Fig 3e)。一方soft-agar colony formation assayでは差を認めず、GTF2I変異が strong transforming oncogene ではなくcell growth-promoting factorとして機能することが示唆された。Immunohistochemistry でMUT腫瘍の核内にTFII-I蛋白高発現を確認、FOS mRNAもMUT腫瘍で高発現 (TFII-I→FOS→cell cycle促進経路を示唆)。
胸腺癌の癌抑制遺伝子集積とコピー数異常：TP53・CYLD・CDKN2A変異が集積 (Fig 1b、Fig 4c)
197-gene panelで胸腺癌に複数の癌遺伝子変異が recurrent に同定された: TP53 (30%)、CYLD (deubiquitinase; tumor suppressor; 11%)、CDKN2A (cyclin-dependent kinase inhibitor 2A; 6%)、BAP1 (BRCA1-associated protein 1; 6%)、PBRM1 (polybromo-1; chromatin remodeler; 4%)。これらは胸腺腫では単発事象 (single events) に留まる一方、胸腺癌では recurrent な集積を示すことが胸腺腫・胸腺癌二分法の分子的根拠となった (Fig 1b)。
コピー数解析 (n=65 aCGH) では最頻 arm-level CNA (copy number aberration): 1q gain (55%)、6p loss (26%)、6q loss (29%)、3p loss (22%)、13q loss (18%)、7p gain (20%)、7q gain (15%)、20p gain (17%)。悪性度の高い組織型 (B2/B3/胸腺癌) でarm-level CNA が多発し、A/ABで少発 (Fig 4c)。Focal CNA ではBCL2 amplification がRNA-seq によるBCL2 mRNA高発現と相関 (Supplementary Fig 6)。組織型別aberration頻度比較 (Fig 4c) はA型から胸腺癌にかけてGTF2I変異を除く変異数・CNA頻度が monotonic に増加することを示した。
考察/結論
本研究はTETのゲノム医学において最重要な landmark であり、これまでの研究がKIT変異を胸腺癌10%に同定するに留まっていたのとは異なり、A型・AB型胸腺腫の主要 driver として GTF2I p.Leu404His を本研究で初めて系統的に records した。単一点変異が特定組織型の82%という高頻度で繰り返し検出されるのは novel な現象であり、がん遺伝学においてBCL2 translocation in follicular lymphoma やBRAF V600E in hairy cell leukemia に匹敵する histotype-defining mutation として位置付けられる。GTF2I は従来Williams-Beuren症候群の発達関連遺伝子としてのみ知られていたが、本研究で初めて human tumor における oncogenic role が提示された。
機能解析の観点では、p.Leu404His変異がTFII-I protein のdestruction box (RXXL motif) 認識を障害してprotein stabilizationを引き起こし、in vitro でNIH-3T3細胞の増殖促進をもたらすことを実証した。MUT alleleの heterozygous expression (~47%) とB/D isoform 選択的発現は、特定のsplicing contextにおける gain-of-function mechanismを示唆する。ただしsoft-agar colony formation assayで差がなく、GTF2I変異はstrong transforming oncogeneではなくcell growth-promoting factorとして作用すると解釈される。
既報と比較した新知見として、(1) GTF2I変異と劇的な予後改善 (10年OS 96% vs 70%、p<0.001) の相関は新規の予後バイオマーカーとしての臨床的意義を確立した。(2) 胸腺癌でのTP53・CYLD・CDKN2A・BAP1・PBRM1の集積は、胸腺腫と胸腺癌が悪性度の連続スペクトルではなく根本的に対照的な分子的疾患実体であることを示す。CYLD (NF-κB (nuclear factor kappa-B) pathway negative regulator) 変異の11%という頻度は、NF-κB活性化を標的とした治療戦略の根拠となる。臨床応用として、(1) GTF2I変異をA/AB型胸腺腫の補助診断マーカーとして活用、(2) 切除不能胸腺腫の予後層別化への応用、(3) bench-to-bedside の観点からTFII-I直接阻害剤の標的化開発、(4) 胸腺癌のCYLD/BAP1変異に基づく NF-κB / Polycomb 阻害剤の臨床試験 が展望される。
残された課題としては、(1) Discovery cohortがn=28と小規模で、B1型・micronodular thymoma等の希少組織型のカバレッジが不十分な点が limitation として挙げられる。(2) GTF2I変異の腫瘍発生における時期的役割 (initiation vs maintenance) は未検証であり、今後の検討が必要である。(3) NIH-3T3線維芽細胞を用いた機能解析は胸腺上皮のcellular contextと乖離があり、胸腺上皮細胞 (TEC) での再現検証が課題となる。(4) TFII-I下流標的の網羅的同定 (ChIP-seq; chromatin immunoprecipitation sequencing) やepigenetic regulatory mechanismの解明は未実施であり、future researchとして残されている。(5) GTF2I変異 vs WT間での化学療法・免疫チェックポイント阻害剤への治療応答差異の解明は今後重要な課題となる。独立cohortでの検証の必要性も著者らが強調している。
方法
Discovery cohort (n=28): NCI Bethesda・Pisa University Hospital・Padua University Hospital・IRCCS Humanitas の4施設からFFPE (formalin-fixed paraffin-embedded) /新鮮凍結組織を収集した28例のTET (胸腺腫21例、胸腺癌7例)。腫瘍細胞含有率 >80% の検体を選択し、正常DNA (隣接非腫瘍組織または全血) との比較でsomatic mutation同定を実施。Alignment: Burrows-Wheeler Aligner (BWA; Li & Durbin 2009)、variant calling: GATK (Genome Analysis Toolkit; McKenna 2010) + Strelka (Saunders 2012)、機能アノテーション: ANNOVAR (variant annotation tool; Wang 2010) + SnpEff (SNP effect predictor; Cingolani 2012) + SIFT (Sorting Intolerant From Tolerant) + PolyPhen-2 (Polymorphism Phenotyping; Adzhubei 2010)。フィルタリング基準: 腫瘍での変異allele ≥4 reads かつ ≥20%、正常では ≤2%。
Validation cohort (n=274): 270 tumors + 4 cell lines (組織型: A型55例、AB型85例、B1型33例、B2型50例、B3型15例、胸腺癌36例)。腫瘍細胞含有率 >50%の199例にSanger sequencing、thymocyte-richな78例を含む250例にdeep sequencing (Fluidigm BioMark HD、MiSeq 500-cycle) を実施した。172例で両手法を並列実施しconcordanceを χ² 検定で評価 (p<0.001)。
197-gene targeted panel: 52例のTETに対しcustom panelでsequencing (うち26例はWES (whole-exome sequencing) と重複)。Agilent capture enrichment → MiSeq 実施。
コピー数解析: aCGH (array comparative genomic hybridization、65例、>80% tumor cell richness) に Nexus 7 解析 + GISTIC (Genomic Identification of Significant Targets in Cancer) アルゴリズムで有意なarm-level/focal CNA領域を同定 (Q bound <0.25、G score >1)。Arm-level CNAは染色体腕の >80% が covered される場合と定義。
RNA-seq: 9例でTopHat (Trapnell 2009) + Cufflinks alignment。GTF2I isoform 5種 (A, B, G, D, 5) のFPKM (fragments per kilobase per million reads) 値推定。FusionMap + DeFuse 2独立アルゴリズムで fusion transcript を同定し RT-PCR + Sanger でvalidation。
機能解析: site-directed mutagenesis で p.Leu404His (B isoform)・p.Leu383His (D isoform) MUT cDNAを作製 → lentiviral vector (pLenti6.3/V5-DEST) で NIH-3T3 cells に安定ectopic発現 → CellTiter-Glo luminescence assay で proliferation 評価 (24/48/72/96 h、3 independent experiments、mean ± s.d.)。soft-agar colony formation assay も実施。Cycloheximide (100 μg/ml) 処理でprotein degradation速度を評価。Western blot: 21 frozen tumors で anti-TFII-I (clone 3E2)、β-actin loading control。Ki67 免疫組織化学 (anti-Ki67 1:50) で増殖指数評価。
生存解析: 204 patients (median follow-up 39.4 months、95% CI 30.3-48.5) でKaplan-Meier法 + log-rank test。Cox比例ハザードモデルで univariate/multivariate 解析 (covariates: WHO histotype grouping、stage、completeness of resection、GTF2I mutation status)。Binomial logistic regression で GTF2I mutation と臨床変数の関連を検討。全検定は両側、有意水準 p<0.05。SPSS version 20使用。