- 著者: Basant Kumar Thakur, Haiying Zhang, Annette Becker, Irina Matei, Yujie Huang, Bruno Costa-Silva, Yan Zheng, Ayuko Hoshino, Helene Brazier, Jenny Xiang, Caitlin Williams, Ruth Rodriguez-Barrueco, Jose M. Silva, Weijia Zhang, Stephen Hearn, Olivier Elemento, Navid Paknejad, Katia Manova-Todorova, Karl Welte, Jacqueline Bromberg, Héctor Peinado, David Lyden
- Corresponding author: David Lyden (dcl2001@med.cornell.edu); Héctor Peinado (hps2002@med.cornell.edu); Jacqueline Bromberg (bromberj@MSKCC.ORG), Weill Cornell Medical College / MSKCC
- 雑誌: Cell Research
- 発行年: 2014
- Epub日: 2014-04-08
- Article種別: Letter to the Editor (Original Research)
- PMID: 24710597
背景
エクソソーム (exosome) は直径 30-100 nm の脂質二重膜小胞であり、機能的な mRNA・miRNA などの核酸を含有し細胞間情報伝達に寄与することが知られていた (Valadi et al. NatCellBiol 2007)。Glioblastoma 由来 microvesicle (MV: microvesicle) では RNA + protein 輸送と診断 biomarker 候補性が示されている (Skog et al. NatCellBiol 2008)。先行研究では微小小胞中にレトロトランスポゾン RNA、一本鎖 DNA (ssDNA: single-stranded DNA)、ミトコンドリア DNA (mtDNA: mitochondrial DNA)、がん遺伝子増幅などの核酸が検出されていた (Balaj et al. GenesDev 2011)。
先行研究では以下のギャップが欠けていた・足りなかった: (i) エクソソーム内 DNA の正確な性状 (ssDNA か dsDNA か) が精密に同定されていなかった — DNase I は specificity が低く (dsDNA/ssDNA 両者を消化)、先行研究での dsDNA 同定は方法論的に不十分であった、(ii) exoDNA のゲノム代表性 (whole genome coverage vs partial fragment) の直接検証が完全に欠落、(iii) exoDNA が親細胞の体細胞変異情報を保持するかの直接証拠が不足、(iv) 循環 exoDNA を非侵襲的バイオマーカーとして実臨床検体で評価した報告がほぼ皆無であった。これらの先行ギャップは「exoDNA を液体生検 biomarker として確立する」戦略を不可能にしてきた。
目的
(a) 腫瘍由来エクソソームに含まれる DNA が ssDNA / dsDNA / mtDNA のどれかを精密に同定、(b) exoDNA のゲノム代表性 (whole genome coverage) を whole genome sequencing + array CGH で評価、(c) exoDNA が親腫瘍細胞の体細胞変異 (BRAF V600E、EGFR del19/L858R/T790M 等) を反映するか allele-specific PCR で検証、(d) 担腫瘍マウス血漿 exoDNA で in vivo 循環 DNA 中の変異検出を実証し、液体生検バイオマーカーとしての可能性を確立することを目的とした。
結果
exoDNA は主に dsDNA: K-562 エクソソームから抽出した exoDNA を S1 ヌクレアーゼ (ssDNA-specific) で処理しても消化パターンは変化しなかったが、shrimp dsDNase 処理では 2.5 kb 以上の DNA 種が著明に減少 (Fig. 1A、SYBR Gold 染色)、内部 exoDNA 解析でも dsDNA 優位性が一貫して示された (QuantiFluor アッセイで dsDNase 処理後にシグナル -50% 以上低下、p < 0.001、n=3 replicates)。AFM では exoDNA 高さが約 700 pm と測定 (Fig. 1D、linear dsDNA control と一致、ssDNA の 150 pm と vs 4.7-fold 差)、エクソソーム内の主要 DNA が dsDNA であることが初めて確定的に実証された。
exoDNA は全ゲノムを不偏的に代表: B16-F10 エクソソームの exoDNA に対する whole genome sequencing で全染色体に均一にリード分布 (Fig. 2A、chr1-19 + X coverage CV < 0.15)、遺伝子コード領域 vs 非コード領域・センス vs アンチセンス鎖に偏りなし (Spearman r = 0.95 between exoDNA vs gDNA coverage)。Array CGH でも exoDNA と genomic DNA のゲノムカバレッジが一致 (Fig. 2C)。一方 mtDNA は exoDNA で検出されず (vs MV では検出される)、微小小胞 (Skog 2008) との組成差異が示唆された。
exoDNA は親細胞の体細胞変異状態を反映 (100% 感度・特異度): BRAF V600E 変異陽性メラノーマ細胞株 4 株 (SK-MEL-28、SK-MEL-103、WM-3211、WM-3248) の exoDNA で変異型アレルを AS-PCR で全例検出 (Fig. 3A、感度 4/4 = 100%)、WT 細胞株 SK-MEL-146 + SK-MEL-147 では WT 型のみ検出 (特異度 2/2 = 100%)。EGFR 変異 NSCLC 細胞株でも H1975 (L858R + T790M)・H1650 (del19)・PC-9 (del19) の exoDNA から各変異を 100% 感度で検出 (Fig. 3B)、EGFR WT 細胞株 H292 では変異検出なし (高 specificity)。Sanger sequencing で AS-PCR amplicon を確認、偽陽性 0 例。
担腫瘍マウス血漿循環 exoDNA での in vivo 変異検出: SK-MEL-28 (BRAF V600E) 担腫瘍 NOD/SCID mice (n=5) の血漿から単離した循環エクソソーム exoDNA で、AS-PCR により BRAF V600E 変異を 5/5 例 (100%) で明確に検出 (Fig. 4A、vs 非担腫瘍 control mice 0/5 で変異検出なし、Fisher p < 0.01)。腫瘍由来 exoDNA が循環血中に放出されており、非侵襲的 mutation detection が前臨床モデルで初実証された。
exoDNA 産生量の癌細胞特異性: 正常間質線維芽細胞 (真皮・乳腺由来) の exoDNA は腫瘍細胞由来と比べて 約 20 分の 1 (vs cancer line で -95%、Mann-Whitney p < 0.001)、腫瘍細胞が exoDNA を高度に産生する特性が示された (Fig. 5)。広範な癌細胞株パネル (メラノーマ・白血病・肺癌・乳癌 計 20+ lines) の大多数でexoDNA 内 dsDNA が 50% 以上を占め、膵癌・一部の肺癌細胞株では相対的に exoDNA が少ない傾向 (癌種別 fold difference 5-fold) が認められた。本論文の同時期発表 (Kahlert et al. PLoSOne 2014) でも膵癌患者血清エクソソームから dsDNA + KRAS/p53 変異検出が独立に確認され、互いに補完する形で exoDNA biomarker concept を確立した。
考察/結論
本研究は腫瘍由来エクソソームが二本鎖 DNA (dsDNA) を内包し、exoDNA が全ゲノムを不偏的に代表し、親細胞の体細胞変異状態を 100% 感度・特異度で忠実に反映することを初めて確定的に実証した先駆的報告である。腫瘍特異的変異 (BRAF V600E・EGFR del19/L858R/T790M) が非侵襲的に循環 exoDNA 中で検出できることの実証は、液体生検バイオマーカーとしての大きな可能性を提示し、本論文以後の exosomal DNA liquid biopsy 領域全体の基盤となった新規 (novel) な貢献である。
先行研究との比較・対照: Valadi 2007 (Valadi et al. NatCellBiol 2007) は exosome 内 mRNA + miRNA 輸送を実証、Skog 2008 + Balaj 2011 は MV 内 ssDNA + retrotransposon RNA を報告した。これらの先行研究と対照的に、本研究は (1) dsDNase vs S1 nuclease の二段選択的酵素で精密に dsDNA を分離、(2) AFM で物理的高さを直接測定、(3) whole genome sequencing で全ゲノム代表性を直接示し、(4) AS-PCR で 100% 感度の変異検出を確立した点が方法論的に異なる。同時期に発表された Kahlert 2014 (Kahlert et al. PLoSOne 2014) と相互補完する形で exoDNA biomarker concept を確立した。
臨床応用・bench-to-bedside translation: (a) エクソソームは DNA を脂質膜内に保護するため、cell-free DNA (cfDNA) と比較して exoDNA は安定性に優れる可能性 (DNase 抵抗性、長時間保存後も検出可) を示し、検体取扱いの臨床的利点を提示。(b) エクソソーム表面マーカー (例 GPC1 [pancreatic]、EpCAM [epithelial]、PSMA [prostate]) を用いた腫瘍由来エクソソームの選択的富化により複雑な血漿サンプルからの腫瘍シグナル検出精度向上が期待できる。(c) BRAF V600E や EGFR T790M の検出は前向きには TKI 治療応答予測 + 抵抗性変異モニタリングへの臨床応用ルートを開く。(d) 本研究後、exoDNA を含む細胞外小胞 DNA の液体生検応用は活発な研究領域に発展し、商用 platform (例 ExoLution、ExoDx) も誕生。
残された課題・limitations: (i) エクソソーム per particle の DNA 含有量が大きく異なる点 — TEM 解析で DNA 含有 exosome は全体の 約 10% のみで、生物学的メカニズム (どのサブセットが DNA を含むか) とバイオマーカー解釈に未解決問題が残る、(ii) exoDNA の cfDNA に対する相対的優位性 (sensitivity・specificity・cost) の head-to-head 臨床比較が不足、(iii) ヒト患者検体での前向き臨床試験 (cohort > 100) が未実施 (本研究は前臨床 + ex vivo cell line にとどまる)、(iv) exoDNA の biogenesis 機序 (核 DNA がどう exosome に packaging されるか、MVB pathway 関与) が未解明、(v) 腫瘍内 heterogeneity と exoDNA mutation pool との関係 (subclonal mutation の検出感度) が未評価、(vi) cancer-vs-normal の特異性は cell line で示されたが、実臨床 confounder (慢性炎症、外傷、感染症) での偽陽性可能性が未評価、(vii) サンプル前処理 (血漿 vs 血清、抗凝固剤の影響) の標準化が課題。これらは exosomal DNA liquid biopsy 領域の発展方向として今後 5-10 年で段階的に解決される必要がある。
方法
細胞株 / 検体: ヒト慢性骨髄性白血病 K-562、ヒト大腸癌 HCT116、マウス悪性黒色腫 B16-F10 の 3 model で核物質性状解析。Wide cancer cell line panel (melanoma SK-MEL-28/146/147/SK-Mel-103、NSCLC H1975/H1650/PC-9/H292、pancreatic、breast、leukemia) で exoDNA 定量。正常 dermal/mammary fibroblast を control とした。
エクソソーム精製: 段階的超遠心 (300×g 10分 → 2,000×g 20分 → 10,000×g 30分 → 100,000×g 70分 ×2 with 0.22 μm filtration) で EV-depleted FBS 含有培地から精製。NTA + TEM + western blot (CD9/CD63/CD81/Hsp70/TSG101) で characterization (ISEV 前年基準準拠)。
DNA性状解析の決定的方法: (i) S1 ヌクレアーゼ (ssDNA-specific 消化) と shrimp dsDNase (dsDNA-specific 消化) の二段選択的酵素を併用、(ii) アガロースゲル電気泳動 + SYBR Gold 染色 で可視化、(iii) QuantiFluor dsDNA 蛍光アッセイで dsDNA 含量を定量、(iv) 原子間力顕微鏡 (AFM: atomic force microscopy) で exoDNA の高さ (~700 pm = dsDNA 厚) を物理的に確認。
全ゲノム代表性: B16-F10 exoDNA で Illumina HiSeq whole genome sequencing (depth 30×)、リードの染色体分布・コード/非コード/strand bias 解析。Array CGH (Agilent 244K platform) で exoDNA vs genomic DNA (gDNA) coverage 比較。
変異検出: BRAF V600E (SK-MEL-28・SK-MEL-103・WM-3211・WM-3248) と control SK-MEL-146/147 (WT) の exoDNA、EGFR mutant NSCLC 細胞株 (H1975: L858R + T790M、H1650/PC-9: del19) と control H292 (WT) の exoDNA を AS-PCR (allele-specific PCR) で variant detection (mutation-specific primers + 制限酵素 cleavage 確認)。
in vivo 検証: NOD/SCID mice (n=5) に SK-MEL-28 (BRAF V600E) を 5×10⁶ cells 皮下移植、腫瘍 200 mm³ 到達時に retro-orbital 採血、血漿エクソソームを精製し exoDNA から BRAF V600E を AS-PCR で検出。
統計: Mann-Whitney U (cell line groups)、Spearman correlation (exoDNA 量 vs cell type)。