- 著者: Maria Francesca Baietti, Zhe Zhang, Eva Mortier, Aurelie Melchior, Gisele Degeest, Annelies Geeraerts, Ylva Ivarsson, Fabienne Depoortere, Christien Coomans, Elke Vermeiren, Pascale Zimmermann, Guido David
- Corresponding author: Pascale Zimmermann; Guido David (Laboratory for Signal Integration in Cell Fate Decision / Laboratory for Glycobiology and Developmental Genetics, KULeuven/VIB, Leuven, Belgium)
- 雑誌: Nature cell biology
- 発行年: 2012
- Epub日: 2012-06-03
- Article種別: Original Article
- PMID: 22660413
背景
エクソソームは、多胞体エンドソーム (MVE/MVB) の腔内小胞 (ILV) が形質膜と融合し細胞外に放出される直径30〜150nmの分泌小胞であり、細胞間シグナル伝達、mRNA/miRNA転送、腫瘍免疫調節において中心的役割を担うことが知られている Thery et al. NatRevImmunol 2002。ILV形成の主要機構としてESCRT (endosomal sorting complex required for transport) マシナリー (ESCRT-0/-I/-II/-IIIカスケード) が示されており、ユビキチン化膜タンパク質を仕分けてエンドソームのILVへの出芽を支援する Wollert et al. Nature 2010。ALIX (ALG-2-interacting protein X) はESCRT構成因子 (TSG101: ESCRT-I、CHMP4: ESCRT-III) と相互作用し、さらにレトロウイルスの膜タンパク質が持つLYPX(n)Lモチーフ (HIV-1 p6のLYPLTSL、EIAV p9のLYPDL) と直接結合してウイルス出芽を仲介することが確立していた。この機構を通じてレトロウイルスはALIXを「乗っ取り」、細胞の膜ドメイン形成マシナリーを利用して細胞から出芽すると考えられている。
シンテニンはSDC (syndecan) 1-4のC末端と高い親和性で結合するPDZスキャフォールドタンパク質であり (PDZ2ドメインがSDC C末端と結合)、エクソソームプロテオームにシンデカン・CD63・ALIX・HSP70とともに高頻度で検出される (ExoCarta解析でALIX・シンテニンはエクソソームに最も頻繁に同定されるタンパク質上位20位以内) ことが先行研究で報告されていた。しかし、シンデカン-シンテニン軸がILV/エクソソーム形成に直接寄与するかは未検討であり、その分子機構は未解明であった。エクソソームの生合成は細胞間コミュニケーションにおいて重要であるにもかかわらず、その分子メカニズムには依然として多くの知識ギャップが残されている。特に、細胞表面に存在するプロテオグリカンがエクソソーム形成にどのように関与するのか、その詳細な経路は不足していた。
シンデカン (SDC1-4) はヘパラン硫酸プロテオグリカン (HSPG) として細胞表面に豊富に発現し (1細胞あたり最大10⁶コピー)、FGF・VEGF等の増殖因子受容体への提示・シグナル強化・発癌・炎症・血管新生に必須の役割を持つ。FGF:FGFR:ヘパラン硫酸三者複合体の形成にはヘパラン硫酸の架橋が必要であり、シンデカンのクラスタリングがこの過程を制御するとされている。これまでの研究では、エクソソームの生合成経路としてテトラスパニン (CD9/CD63) 依存的経路やセラミド依存的経路などが報告されてきたが Trajkovic et al. Science 2008、これらの経路が細胞表面のプロテオグリカンとどのように連携するのか、あるいは独立した経路が存在するのかについては不明な点が多かった。本研究は、この知識ギャップを埋めることを目的とする。
目的
本研究の目的は、シンデカン-シンテニン-ALIX三者複合体がエクソソームの生合成に直接的役割を果たすか検証することである。具体的には、以下の点を明らかにすることを目指した。(1) シンテニンとALIXの相互作用の分子基盤を解明し、レトロウイルス後期ドメイン (LYPX(n)Lモチーフ) との類似性を評価する。(2) シンテニン、シンデカン、ALIXといった各成分がエクソソーム形成に与える機能的寄与を定量的に評価する。(3) この経路がESCRTマシナリーに依存するかどうか、およびその依存性の詳細を解析する。(4) ヘパラン硫酸の存在がエクソソーム形成に必須であるかを検証する。(5) FGFシグナル伝達物質がエクソソームに選択的に積荷されるメカニズムと、シンデカン-シンテニン-ALIX経路がその分配にどのように関与するかを明らかにすることを目指した。これらの目的を達成することで、エクソソーム生合成における新たな制御経路を確立し、細胞膜輸送とシグナル伝達におけるヘパラン硫酸プロテオグリカンの役割を深く理解することを目指した。
結果
シンテニン-ALIX直接結合の分子機構 — ウイルス後期ドメインとの相同性: シンテニンN末端100アミノ酸ドメインに3つのLYPX(n)Lモチーフ (HIV-1 p6のLYPLTSL、EIAV p9のLYPDLと構造相同) が存在し、これらがALIX V-domainのPhe676中心部と直接結合することをY2Hおよびin vitro結合アッセイで確立した (Fig. 1a)。3モチーフ全てのYP→AA置換でシンテニン-ALIX結合が消失し、ALIX Phe676Asp変異体でもシンテニン結合が完全に喪失した (Supplementary Fig. S1a,d)。Biacore (SPR) ではシンテニンがSDC2とKd = 1.8 μM、CD63とKd = 24 μM で結合し、シンテニンのSDCへの親和性がCD63の約10倍であることが示された (Fig. 1d)。三者複合体 (SDC2:シンテニン:GST-ALIX) のin vitro形成もBiacoreで実証された (Fig. 1c)。Y2Hで各LYPX(n)Lモチーフが個別にALIXと相互作用し、全3モチーフが協調して結合強度を規定することが確認された。
エクソソームへのシンデカン・シンテニン・ALIXの共局在と物理化学的特性: MCF-7細胞由来のHSCエクソソームは直径88±13nm (NTA測定、n=137 particles)・密度1.094〜1.143 g/mL (勾配遠心) の粒子集団からなり、SDC1-CTF・シンテニン・ALIX・CD63・HSP70が濃縮されていた (Golgi・ER・リソソームマーカー陰性) (Fig. 1e,f,g,h)。CD63-magnetic beadサブフラクション化では、シンデカン・シンテニンのCD63陽性エクソソームへの有意な共分画が確認され (p<0.001、t検定)、flotillin-1はCD63非依存的に別フラクションに分布した (Fig. 1j)。二色蛍光相関分光 (FCS) でCD63陽性エクソソームの大部分がシンテニンを含むことが確認された (Supplementary Fig. S2c,d)。これらの結果は、シンデカン、CD63、シンテニン、ALIXが、flotillin-1陰性の特徴的なクラスの小胞に主に共分離することを示唆する。
シンテニン過発現・ノックダウンによるエクソソーム産生量の定量的制御: シンテニン野生型過発現により、エクソソーム中のSDC・シンテニン・ALIX・CD63・HSP70が増加し、NTAで直径30〜110nm粒子が約2倍増加した (Fig. 2a,c, Supplementary Fig. S3b)。蛍光分光法によるmGFP-CD63エクソソーム計数では粒子数が2〜3倍増加したが、各粒子の蛍光強度 (CD63積荷量) は変化しなかった (Fig. 2d, Supplementary Fig. S3c)。これによりシンテニンがエクソソームの積荷量ではなく産生数を制御することが示された。対照的に、ALIX結合欠損シンテニン (triple LYP→LAA mutant) 過発現ではエクソソーム増加が認められず、ALIX相互作用がシンテニン機能に必須であることが確認された (Fig. 2a,c)。siRNA-シンテニン・siRNA-SDC・siRNA-ALIXのいずれも、エクソソーム中のシンテニン・SDC1-CTF・CD63・HSP70を有意に減少させた (Fig. 3a,b,d)。NTAではSDC/シンテニン/ALIXノックダウンで小粒子が約50%減少した (Supplementary Fig. S3b)。一方、CD63ノックダウンはエクソソーム中のシンデカン・シンテニン・ALIX・HSP70に大きな影響を与えず、シンテニン-ALIX軸がCD63下流ではなく独立して機能することが示された (Fig. 3c,d)。SDCノックダウン下でのCD63 OE (CD63過発現) はエクソソームシンテニン・ALIXをさらに減少させ、CD63とシンデカンの競合的なPDZドメイン結合が想定された (Fig. 3e,f)。これらの実験はn=3 independent experimentsで実施された。
エンドソーム起源の確認とILV形成への直接関与: cer-RAB5Q79L (拡大エンドソーム誘導因子) 過発現でSDC・CD63・シンテニン・ALIXのエクソソーム放出が著明に減少し (エンドソーム内に蓄積)、エクソソームがエンドソーム由来であることを示した (Fig. 4a)。共焦点顕微鏡でmCherry-シンテニン・シンデカンICD・ALIX・CD63がRAB5Q79L-GFP装飾の拡大エンドソーム腔内に蓄積し、シンデカンECドメインはエンドソーム限界膜のみに局在することが可視化された (Fig. 4b)。RAB7ノックダウンでもシンテニン含有エクソソームが著明に減少し、RAB7シグナルがMVBの後期エンドソーム成熟と細胞表面への融合に必須であることが確認された (Fig. 4d)。電子顕微鏡でも、シンテニンsiRNA細胞では抗CD63-HRP染色がエンドソーム限界膜寄りに局在し、対照細胞ではILVが充填されることが示された (Fig. 4f,g)。シンテニンノックダウンにより、染色されたエンドソームの平均サイズも有意に減少した (Supplementary Fig. S5c)。これらの結果は、シンテニンがエンドソーム内腔へのILV形成に直接関与することを示唆する。
ESCRT依存性の解析 — 非典型的サブセット: TSG101 siRNA・VPS22 (ESCRT-II) siRNA・CHMP4A/B/C siRNAはエクソソームのSDC-CTF・シンテニン・CD63を有意に減少させた (Fig. 5a)。CHMP2A siRNAでも形成が著明に抑制されたが、CHMP3・CHMP6 siRNAでは影響がなかった (Fig. 5d)。VPS4A/B siRNA (ATPase siRNA) は産生を減少させたが、ドミナントネガティブVPS4A K173Q (ATP結合欠損) 発現は産生に影響しなかった (Fig. 5d)。この非典型的VPS4依存性パターン (機能阻害には影響なし、発現量低下は影響あり) はHIV-1出芽のESCRT要件と類似し、シンテニン/LYPX(n)L-ALIX経路がCHMP6を介さずにCHMP4を直接動員することで一部の標準的ESCRT-IIIプロセスを迂回する可能性が示唆された。ALIX I212D (CHMP4結合欠損) 変異体はALIX RNAi下での野生型ALIXによるエクソソーム救済に失敗し、CHMP4との結合がALIX機能に必要であることが確認された (Fig. 5c)。これらのデータはn=3-6 independent experimentsから得られた。
ヘパラン硫酸・シンデカンクラスタリング・CTF産生の役割: EXT1/2 siRNA (HS鎖合成酵素)、NDST1/2 siRNA (HS硫酸化酵素)、Heparitinase処理 (HS鎖除去) のいずれもエクソソームシンテニン・SDC1-CTF・CD63放出を著明に減少させた (Fig. 6a)。抗シンデカン抗体によるSDCクラスタリング誘導は条件依存的にエクソソーム産生に影響し、EXT1/2 siRNA下では抗体救済が可能であった (Fig. 6b)。SDCのN末端欠損型 (CTF模倣型) 過発現はSDCノックダウン下でのエクソソーム回復に失敗した (Fig. 6c)。Cathepsin阻害薬でSDC-CTF蓄積を40%減少させるとSDCノックダウンとの相乗的なエクソソーム減少が生じた (Fig. 6e)。これらより、全長SDCのヘパラン硫酸依存的クラスタリング (エンドソームへの動員と最初の集積) と続くプロセシング (CTF生成) が相補的に必要であることが示された。
FGFシグナリング積荷の選択的エクソソーム分配: FGF2 (2 ng/mL) 刺激はエクソソームのCD63・シンテニン含有量を増加させ、SDCノックダウンはこのFGF効果を減弱させた (pERK = FGFシグナリング自体は維持) (Fig. 6f)。シンテニン過発現はHA-FGFRのエクソソーム放出を増加させたが、この増加はSDCノックダウンおよびFGFなしの条件で消失した (Fig. 6g)。すなわちFGF:FGFR複合体のシンデカンへの結合→シンデカンのクラスタリング誘導→シンテニンALIX動員→エンドソームへの組み込みという連鎖的経路が示された。これらの結果は、FGFシグナルがシンデカン-シンテニン-ALIX経路を介してエクソソームに選択的に積荷されることを示唆する。
考察/結論
本研究はシンデカン-シンテニン-ALIX三者複合体が、レトロウイルス出芽機序に構造的に類似したLYPX(n)L-ALIX V-domain相互作用 (Kd: シンテニンとSDC2は1.8 μM) を通じてESCRT依存的エンドソームILV形成を促進し、エクソソームの産生数 (個々のエクソソームへのCD63積荷量ではなく) を制御するという新規経路を確立した。
新規性: 本研究の独自性と主要な寄与は3点である。第一に、細胞表面の豊富なプロテオグリカン (シンデカン) が細胞内膜輸送 (エクソソームILV形成) を制御するという概念的に新規な経路の発見である。第二に、ウイルス出芽 (LYPX(n)L-ALIX) と細胞のエクソソーム形成に共通の分子機構があることの実証である — これは「細胞のエンドソーム輸送をウイルスが模倣している」という概念から「ウイルスと細胞が共通祖先的な出芽機構を共有している」という視点への転換を示唆する。第三に、ヘパラン硫酸の細胞表面可用性がエクソソーム産生量を調節するという知見である — 炎症・腫瘍環境でのヘパリナーゼ活性増大がエクソソーム分泌量を変動させる可能性を示唆する。本研究で初めて、シンデカン-シンテニン-ALIX複合体がエクソソーム生合成を制御する詳細な分子メカニズムを明らかにした。
先行研究との違い: 本経路は、テトラスパニン (CD9/CD63) 依存的経路やセラミド依存的経路 Trajkovic et al. Science 2008 とは独立した「第三の並行経路」として位置付けられる点で、これまでの報告とは異なる。シンテニンがCD63よりSDCに約10倍高い親和性を持つことは、この経路の特異性を支持する。これは、これまで報告されてきたエクソソーム生合成経路とは異なる、新たな制御メカニズムを提示するものである。
臨床応用: 臨床的・病態生理学的含意として、SDC-シンテニン-ALIX経路の活性化または脱制御が、癌・プリオン伝播・炎症・アミロイド沈着・神経変性疾患に関与するエクソソームを介した病原シグナルの伝播に貢献しうることが提示された。また、腫瘍微小環境でのFGFシグナルのエクソソームへの封入・放出による傍分泌シグナルの調節は、腫瘍血管新生・免疫調節の機序として臨床的に重要である。ヘパリン系薬剤などHSPG機能調節物質がエクソソーム生合成の治療標的となりうる可能性も示唆される。これらの知見は、将来的な診断や治療法の開発に繋がる臨床応用への道を開くものである。
残された課題: 今後の検討課題として、in vivo動物モデルでの経路の機能検証、SDCサブタイプ特異性の詳細、シンテニンのALIX以外の相互作用パートナー (ephrin-B1/2・Frizzled) との協調機構、および細胞種・分化段階によるヘパラン硫酸構造の多様性がエクソソーム内容物選択性に与える影響の解明が残されている。また、本研究で観察された非典型的なESCRT依存性メカニズムのさらなる詳細な解析も今後の研究で必要である。
方法
主要細胞モデルとして、MCF-7乳癌細胞 (SDC1・SDC4・シンテニンが豊富でエクソソーム様粒子を多数放出) を使用した。一部の実験ではHeLa細胞も使用した。
相互作用解析: Yeast two-hybrid (Y2H) 法を用いて、シンテニンN末端ドメインとALIX V-domainの相互作用をスクリーニングした。シンテニンN末端に3つのLYPX(n)Lモチーフを同定し、YP→AA点変異 (全3モチーフ) 導入により結合消失を確認した。ALIX Phe676Asp変異体でもシンテニン結合の喪失が認められた。内在性タンパク質の共免疫沈降により、SDC:シンテニン:ALIXの三者複合体がin vivoで形成されることを確認した。Biacore SPR (表面プラズモン共鳴) 法を用いて、シンテニン (非タグ組換えタンパク質) とSDC2との結合Kdを1.8±0.2 μMと測定し、シンテニンとCD63との結合Kdを24±4 μMと測定した。これにより、シンテニンのSDCへの親和性がCD63の約10倍高いことが示された。in vitroでの三者複合体 (SDC2:シンテニン:GST-ALIX) の形成もBiacoreで確認した。
エクソソーム精製と特性評価: 差速高速遠心分離 (HSC) 法により、300g→2,000g→10,000g→100,000gの4段階遠心でエクソソームペレットを回収した。Nanoparticle tracking analysis (NTA) により、精製された粒子の平均粒径が88±13nm (平均±SD、n=137 particles) であることを確認した。密度勾配遠心法により、エクソソームが密度1.094〜1.143 g/mLの分画に存在することを確認した。Western blotにより、SDC1-CTF・シンテニン・ALIX・CD63・HSP70がエクソソームに濃縮されていることを確認し、GM130 (Golgi)、カルネキシン (ER)、LAMP-2 (リソソーム) のマーカーは陰性であった。電子顕微鏡によりILV形態を確認した。抗CD63-HRP共役体を内部移行させ、DABで染色することでエンドソームのILV充填を可視化した。
機能解析 (gain/loss of function): シンテニン野生型の一過性過発現とALIX結合欠損型 (triple LYP→LAA mutant) 過発現を比較した。SDC・シンテニン・ALIX・各ESCRT成分に対するsiRNA (ON-Target plus Smartpools、Dharmacon) を用いてノックダウン実験を行った。救済実験として、SDCノックダウン下でマウスSDC1またはmGFP-CD63を外来的に過発現させた。共焦点顕微鏡により、mCherry-シンテニンとcer-RAB5Q79L (拡大エンドソーム誘導) を用いてエンドソーム内腔へのILV形成を可視化した。RAB7ノックダウンによりMVBから細胞外への放出経路を確認した。蛍光分光法 (confocal fluorescence spectroscopy) により、mGFP-CD63含有エクソソームの粒子数を定量した。
ヘパラン硫酸の必要性: EXT1/2 siRNA (HS合成酵素)、NDST1/2 siRNA (硫酸化酵素)、Heparitinase処理によりHSの除去・修飾を行った。
FGF積荷実験: HA-FGFR過発現細胞にFGF2 (2 ng/mL) を添加し、各時点のエクソソームをWestern blotでFGFR量を定量した。シンテニン過発現 (OE) vs 対照 vs SDCノックダウンの条件で比較した。統計解析には二項t検定 (two-tailed t test) およびMann Whitney検定を用いた。