- 著者: Katarina Trajkovic, Chieh Hsu, Salvatore Chiantia, Lawrence Rajendran, Dirk Wenzel, Felix Wieland, Petra Schwille, Britta Brügger, Mikael Simons
- Corresponding author: Mikael Simons (Max-Planck-Institut für Experimentelle Medizin, Göttingen, Germany)
- 雑誌: Science
- 発行年: 2008
- Epub日: N/A
- Article種別: Original Article
- PMID: 18309083
背景
エクソソームは、細胞間シグナル伝達において多様な役割を果たすことが報告されている細胞外小胞であり、エンドサイトーシス経路の後期エンドソームである多胞体エンドソーム (MVE) の内腔に形成された内腔小胞 (ILV) が細胞外に放出されたものである (Thery et al. NatRevImmunol 2002; Stoorvogel et al. Traffic 2002; van Niel et al. J Biochem 2006)。ILV 形成には、ESCRT (endosomal sorting complex required for transport) と呼ばれる多タンパク質複合体が中心的役割を担うことが知られており、ESCRT-0 (Hrs)/ESCRT-I (Tsg101)/ESCRT-II/ESCRT-III (Vps4 ATPase を含む) の順次作動がユビキチン化カーゴを MVE 内腔へ仕分ける古典的経路として確立されていた (Hurley & Emr Annu Rev Biophys 2006; Williams & Urb Nat Rev Mol Cell Biol 2007)。この ESCRT 経路は、主にユビキチン化された膜タンパク質をリソソーム分解経路へと導く役割を担う。
しかし、グリコシルホスファチジルイノシトール (GPI) アンカータンパク質やプロテオリピドタンパク質 (PLP) のような脂質ラフト (lipid raft) 関連カーゴは、ユビキチン化に依存せず、ESCRT 分解経路とは異なるエンドソームサブドメインに局在することが観察されていた。これらのカーゴがエクソソームとして分泌される分子機序は完全に未解明であり、ESCRT 非依存的な ILV 形成経路の存在に関する知識は手薄であった。特に、「どの脂質成分がラフト相からの内腔方向への出芽を物理的に駆動するか」という知識のギャップは埋まっておらず、セラミドが負の自発曲率をもつコーン型脂質としてドメイン融合・膜変形を誘導しうることは生物物理学的に示唆されていたものの (Holopainen et al. Biophys J 2000; Zha et al. J Cell Biol 1998; Li et al. J Biol Chem 1999)、エクソソーム生合成における直接的かつ必須の役割を実証した研究は存在しなかった。このため、ESCRT 非依存的なエクソソーム形成経路の分子メカニズム、特に脂質が果たす役割については、さらなる詳細な解析が不足していた。
目的
本研究の目的は、マウスオリゴデンドロサイト細胞株 Oli-neu を用いて、エクソソームカーゴであるプロテオリピドタンパク質 (PLP) の MVE 内腔への積み込みおよび分泌が ESCRT (endosomal sorting complex required for transport) 機構に非依存的であることを系統的に証明することであった。さらに、スフィンゴミエリン加水分解酵素である中性スフィンゴミエリナーゼ 2 (nSMase2) が産生するセラミドが、MVE 内腔への出芽を駆動する新規経路を同定することを目的とした。本研究では、精製エクソソームの脂質プロファイル解析と、GUV (giant unilamellar vesicle) を用いた無細胞モデル実験により、セラミドが膜出芽を物理的に誘導するメカニズムを検証することも目的とした。これにより、ESCRT 非依存的なエクソソーム生合成におけるセラミドの必須性と、その物理化学的役割を明らかにすることを目指した。
結果
PLP のエンドソーム依存的エクソソーム分泌と ESCRT 非依存性の確立: プロテオリピドタンパク質 (PLP) は、Oli-neu 細胞の培養上清から逐次遠心分離により得た 100,000g ペレット (P100) に大量に回収された (Fig. 1A)。透過型電子顕微鏡 (TEM) 解析により、P100 には直径 50-100nm の均一な膜小胞が含まれることを確認し (Fig. 1B)、スクロース密度勾配 (0.25 to 2.5M) フローティングでは PLP がエクソソームマーカー Alix と同一画分に濃縮され (Fig. 1C)、PLP が真のエクソソームに組み込まれていることを確証した。ER 保留型の変異体 msd-PLP (A242V 置換、ER で誤折り畳み) は P100 に検出されず、P100 への PLP 回収が細胞溶解によるアーチファクトではないことを示した。エンドソーム機能を抑制するため、GTPase 欠損型 GFP-Rab5 Q79L (Rab5 の 79 位グルタミンをロイシンで置換した GTPase 欠損変異体) を共発現させると、PLP の P100 への回収量が著明に減少した (約3-fold の減少; P<0.01、n=5 experiments、mean±SD; Fig. 1D/E)。一方、形質膜から直接出芽する Gag-YFP (Moloney murine leukemia virus Gag 融合イエロー蛍光タンパク質) のウイルス様粒子放出は Rab5 Q79L の影響を受けなかった (Fig. 1E)。これにより、PLP のエクソソーム分泌がエンドソーム経路を必須とすることが確認された。 ESCRT (endosomal sorting complex required for transport) 機能阻害の影響を検証した結果、Hrs siRNA ノックダウンまたは Tsg101 siRNA ノックダウンはいずれも EGFR/EGF の内腔輸送を有意に抑制したが、PLP の内腔輸送は影響を受けなかった (fig. S4)。Alix siRNA は EGF 輸送に軽度の影響のみを示し、PLP には無影響であった。優性阻害型 Vps4 の発現も PLP エクソソーム分泌を抑制せず、CD63-EGFP の分泌も同様に Vps4 阻害の影響を受けなかった (fig. S9)。一方、ESCRT に依存して出芽する Gag-YFP は優性阻害型 Vps4 発現により放出が著明に減少した (fig. S7)。これらの結果から、PLP のエクソソーム積み込みは ESCRT に非依存的であることが確立された。
エンドソーム内サブドメイン構造：PLP のラフトドメインへの選択的局在: Rab5 Q79L で拡大させたエンドソームの共焦点免疫蛍光解析により、エンドソーム膜上に少なくとも 2 種類の機能的に異なるサブドメインが存在することが明らかになった (Fig. 2)。Hrs (ESCRT-0 コンポーネント) および EGFR はエンドソーム膜上のクラスリンコートマイクロドメインに共局在し、ユビキチン化カーゴの分解経路輸送を担っていた (n=~25 endosomes の定量解析で確認)。対照的に、PLP はこれらの Hrs 陽性ドメインおよび EGFR 陽性ドメインとほとんど共局在せず、代わりに flotillin-2 (脂質ラフトのスキャフォールドタンパク質) および GPI-CFP (グリコシルホスファチジルイノシトール融合シアン蛍光タンパク質、ラフトマーカー) と同一サブドメインに共局在した (Fig. 2)。すなわち、PLP はラフト相のエンドソームサブドメインに選択的に集積し、Hrs/EGFR 主導の分解経路サブドメインとは空間的に隔離されていた。このサブドメインの分離は、異なる ILV 形成経路が存在することを示唆する。
エクソソームの特徴的脂質組成：セラミドの選択的濃縮: ナノ ESI-MS/MS (ナノエレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析) による網羅的脂質解析では、エクソソーム (P100 画分) と全細胞膜 (CM) の脂質組成が顕著に異なることが示された (Fig. 3A/B/C)。エクソソームはコレステロール、スフィンゴミエリン (SM)、ヘキソシルセラミドについて全細胞膜比で富化されており、ホスファチジルコリン (PC) は相対的に低値であった (n=3 独立実験、mean±SD)。PC 分子種解析では、エクソソーム中の飽和 PC が増加し多価不飽和 PC が減少しており、膜流動性が低い液体秩序相 (ラフト相) に相当するリピドームプロファイルを示した (Fig. 3B)。最も重要な発見として、セラミドがエクソソーム中に全細胞膜と比較して顕著に濃縮されていることが明らかとなった (Fig. 3C)。セラミドは SM のスフィンゴミエリナーゼ (SMase) による加水分解で産生されるコーン型脂質であり、小さい極性頭部と大きい疎水性尾部をもつ負の自発曲率を示す。セラミドのこの物理化学的特性がエクソソームへの濃縮と関連し、内腔方向への膜変形を促進する分子基盤として機能すると示唆された。
nSMase 阻害によるエクソソーム放出の選択的抑制とセラミド依存性の確立: セラミド産生の生理的触媒である中性スフィンゴミエリナーゼ (nSMase) を阻害することでエクソソーム放出が選択的に抑制されるか検証した (Fig. 4A/B)。構造的に非関連な 3 種の nSMase 阻害剤 — GW4869 (5μM)、スピロエポキシド (5μM)、グルタチオン (5mM) — はいずれも PLP 含有エクソソームの P100 への回収量を有意に減少させた (GW4869: cell lysate 補正後のコントロール比で約2-fold の減少 [約50%]; P<0.001、n=3〜6 experiments、mean±SD)。これに対し、形質膜から直接出芽する Gag-YFP のウイルス様粒子放出はいずれの nSMase 阻害剤によっても影響を受けなかった。この選択性は、nSMase 阻害がエンドソームの全般的機能を障害するのではなく、エクソソーム形成に特異的な経路を標的としていることを示す。nSMase 阻害 (GW4869) 後にエンドソーム内腔への PLP 輸送量を定量すると、コントロール比で約2-fold（40〜50%）の減少を示した (P<0.001; n>40 endosomes; mean±SE; Fig. 4D)。同条件下で VSV-G (水疱性口内炎ウイルス G タンパク質) の内腔輸送量は変化せず (Fig. 4C/D)、EGF 分解も障害されなかったことから (fig. S12)、GW4869 の効果がエンドソーム経路全般の障害ではなく PLP 輸送経路の特異的阻害であることが確認された。さらに、nSMase2 (中性スフィンゴミエリナーゼ 2) に特異的な siRNA ノックダウンによっても PLP エクソソーム放出が有意に抑制された (P<0.05; n=3 experiments; Fig. 4A/B) が、Gag-YFP 放出は抑制されなかった。これにより nSMase2 が本エクソソーム経路の必須酵素であることが遺伝学的に確定した。
GUV モデルによるセラミド誘発膜出芽のメカニズム的証明: ESCRT タンパク質を含まない無細胞系でセラミドが内腔方向への膜出芽を駆動できるか検証するため、DOPC (ジオレオイルホスファチジルコリン)/SM/コレステロール混合 GUV (giant unilamellar vesicle) モデルを用いた (Fig. 4E)。液体無秩序相 (liquid-disordered phase) を DiD-C18 (赤) で、液体秩序相 (ラフト様 liquid-ordered phase) を Bodipy-コレステロール (緑) でそれぞれ標識し、二相を明確に識別した状態で Staphylococcus aureus 由来 SMase を外部添加した。SMase 添加直後から、Bodipy-コレステロール陽性の液体秩序相ドメインから選択的に小さな小胞が出芽し GUV 内腔に蓄積する様子が共焦点顕微鏡で観察された。液体無秩序相からの出芽は認められなかった。この結果は、ラフト相に存在する SM が SMase によりセラミドへ変換されることで、タンパク質機構を必要とせず物理化学的原理のみで内腔方向への膜出芽が起こることを直接的に証明した。
考察/結論
本研究は、エクソソーム生合成において ESCRT (endosomal sorting complex required for transport) 依存経路とは完全に独立した第二の経路が存在することを、これまで報告されていない形で確立した。プロテオリピドタンパク質 (PLP) はオリゴデンドロサイト細胞で ESCRT コンポーネント (Hrs・Tsg101・Alix・Vps4) に非依存的に MVE 内腔に蓄積し、nSMase2 (中性スフィンゴミエリナーゼ 2) が産生するセラミドを必要とする新規な出芽経路によってエクソソームとして放出される。この発見はエクソソーム生物学に概念的転換をもたらした。
先行研究との違い: EGFR など古典的な分解経路カーゴはユビキチン化→Hrs→Tsg101→ESCRT-III→Vps4 の順次作動によって MVE 内腔に輸送されるが、PLP/flotillin/GPI-CFP などのラフト関連カーゴは EGFR が辿る ESCRT 依存経路と異なり、Hrs とは隔離されたエンドソームサブドメインに局在し、全 ESCRT コンポーネントのノックダウン後もエクソソーム分泌量が有意に減少しないことを本研究は示した。ESCRT 依存的内腔輸送では EGF・VSV-G が Hrs/Tsg101 ノックダウンで著明に抑制されるのとは対照的であり、二経路の分岐はエンドソーム膜上のラフト/非ラフトサブドメイン形成の段階で決定されることが示された。なお、Pmel17 のメラノソームへの輸送が ESCRT 非依存的であるという既報 (Theos et al. Dev Cell 2006) および CD63 の Vps4 非依存的分泌 (Fang et al. PLoS Biol 2007) とも本研究の結論は一致する。
新規性: セラミドという単一の脂質分子が、タンパク質を介さず物理化学的原理のみで膜の内腔方向への出芽を駆動できることが本研究で初めて示された。コーン型脂質であるセラミドは小さな極性頭部がもたらす負の自発曲率によって、ラフトドメイン内に面積差を生じさせ内腔方向への膜弯曲を自発的に誘導する。さらにセラミドは小さなスフィンゴミエリンリッチなドメインを大きな液体秩序相ドメインへと融合させる能力をもつことから (Gulbins & Kolesnick Oncogene 2003)、ラフトドメインの成長と出芽の両過程を同時に促進すると考えられる。lysobisphosphatidic acid がリポソーム内で内腔小胞形成を誘導するという既報 (Matsuo et al. Science 2004) との比較では、lysobisphosphatidic acid がリソソーム分解経路向け ILV に機能するのに対し、本研究のセラミドは分泌型エクソソーム経路に特異的であることが対照的であり、脂質によって ILV の運命 (分解 vs. 分泌) が規定されるという新たな概念が提示された。
臨床応用: nSMase2 とそのセラミド産生が特定のエクソソームサブセット放出を制御するという本研究の発見は、エクソソームを介した疾患進展メカニズムの理解に直接的な臨床応用の可能性を示す。GW4869 は本論文で確立されたツール化合物として、その後のがん細胞・免疫細胞・神経細胞など多様な細胞種でのエクソソーム分泌阻害実験に bench-to-bedside の橋渡し化合物として広く利用されるようになり、腫瘍由来エクソソームを介した免疫抑制や転移前微小環境形成 (Hoshino et al. Nature 2015) の抑制という治療戦略の前臨床的検証に不可欠なツールとなった。セラミド経路を標的とした エクソソーム生合成経路 介入の可能性は、液性バイオマーカー開発や EV 産生の薬理学的制御という観点から引き続き重要な研究対象である。
残された課題: 本研究はオリゴデンドロサイト細胞株を用いた in vitro モデルに基づいており、他の細胞種でのセラミド依存的エクソソーム経路の普遍性、および in vivo での生理的・病理的役割の検証が今後の課題として残された。また、PLP 以外のラフト関連カーゴがどのようにセラミド依存的経路に選択的に積み込まれるかの認識機構、Rab GTPase 群 (Rab27a 等) とセラミド経路の相互作用、ならびに Thery et al. JExtracellVesicles 2018 準拠の現代的 EV 解析法で検証すべき側面も limitation として指摘される。さらに、がん細胞や免疫細胞において nSMase2 活性が変動するシナリオでセラミド依存的エクソソーム経路が病態生理にどの程度寄与するかについて、今後の研究が必要である。がん EV の機能と多様性については Kalluri et al. Cell 2023 が包括的に整理しており、本論文が確立した biogenesis 基盤は現代の EV 研究の重要な参照点となっている。
方法
細胞モデルと発現系: マウスオリゴデンドロサイト細胞株 Oli-neu を主要細胞モデルとして使用した。エクソソームカーゴとして PLP-EGFP/PLP-Myc (プロテオリピドタンパク質、エクソソームモデルカーゴ)、形質膜出芽コントロールとして Gag-YFP (Moloney murine leukemia virus Gag、ウイルス様粒子形成マーカー)、内腔輸送コントロールとして VSV-G (水疱性口内炎ウイルス G タンパク質) を一過性または安定発現させた。エンドソーム成熟阻害には、優性阻害型 GFP-Rab5 Q79L (Rab5 の 79 位グルタミンをロイシンで置換した GTPase 欠損変異体) を共発現させ、拡大エンドソームを生成した。
EV 単離法 (differential ultracentrifugation): 培養上清を逐次遠心分離に供した。具体的には、300g で細胞を除去し、2,000g で死細胞・細胞デブリを除去、10,000g で大型小胞を除去した後、100,000g でエクソソーム富化ペレット (P100) を回収した。得られた P100 が主要解析対象である。EV 特性評価 (characterization) は、透過型電子顕微鏡 (TEM; 1% ウラニル酢酸ネガティブ染色 + 抗 PLP 免疫標識) による形態観察 (直径 50-100nm の小胞)、スクロース密度勾配 (0.25 to 2.5M) フローティングアッセイでの浮遊特性確認、および陽性マーカー (Alix・flotillin-2) および陰性マーカー (ER・Golgi・早期エンドソームタンパク質) のウエスタンブロット解析を組み合わせた。これらの手法は、当時のエクソソーム研究における標準的なプロトコルに準拠している。
ESCRT 機能阻害実験: ESCRT 複合体の各コンポーネントに対して、(1) siRNA ノックダウン (Hrs、Tsg101、Alix に対する RNAi)、(2) 優性阻害型変異体の過剰発現 (dominant-negative Vps4)、(3) Tsg101 過剰発現 (HIV-1 出芽阻害既報) の 3 種の戦略を組み合わせて使用し、PLP・Gag-YFP・CD63 (EGFP 融合) のエクソソーム分泌量を定量した。内腔輸送解析は、Rab5 Q79L 拡大エンドソームに GW4869 処理または nSMase2 siRNA を組み合わせ、内腔対膜蛍光強度比で PLP の内腔輸送量を定量した (n>40 endosomes)。
脂質解析: ナノエレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析 (nanoESI-MS/MS) により、エクソソーム画分 (P100) と全細胞膜 (CM) の脂質分子種組成を定量比較した。解析対象脂質は、スフィンゴミエリン (SM)、ヘキソシルセラミド、セラミド、ホスファチジルコリン (PC)、ホスファチジルエタノールアミン (PE)、ホスファチジルセリン (PS)、およびコレステロールであった。
nSMase 阻害実験: 構造的に非関連な 3 種の nSMase 阻害剤 — GW4869 (5μM)、スピロエポキシド (5μM)、グルタチオン (5mM) — を PLP-EGFP 安定発現 Oli-neu 細胞に処理し、P100 中の PLP 量を cell lysate 中の PLP 量で規格化して定量した。nSMase2 特異的ノックダウンは siRNA のヌクレオフェクション法で実施した。
GUV モデル実験: DOPC (ジオレオイルホスファチジルコリン)/SM/コレステロール混合脂質から GUV を調製し、液体無秩序相マーカー DiD-C18 (赤) と液体秩序相マーカー Bodipy-コレステロール (緑) で二相を標識した。Staphylococcus aureus 由来 SMase を外部添加し、共焦点顕微鏡で SMase 添加前後の膜動態をリアルタイムで観察した。
統計解析: 結果は mean±SD または mean±SE で表記し、有意差検定には one-sample t test (コントロール 100% との比較) または対応のある t test を使用した (P<0.05 を有意水準として採用)。n=3〜6 独立実験の結果を集計した。