- 著者: Nicholas McGranahan*, Andrew J. S. Furness*, Rachel Rosenthal*, Sofie Ramskov, Rikke Lyngaa, Sunil Kumar Saini, Mariam Jamal-Hanjani, Gareth A. Wilson, Nicolai J. Birkbak, Crispin T. Hiley, Thomas B. K. Watkins, Seema Shafi, Nirupa Murugaesu, Richard Mitter, Ayse U. Akarca, Joseph Linares, Teresa Marafioti, Jake Y. Henry, Eliezer M. Van Allen, Diana Miao, Bastian Schilling, Dirk Schadendorf, Levi A. Garraway, Vladimir Makarov, Naiyer A. Rizvi, Alexandra Snyder, Matthew D. Hellmann, Taha Merghoub, Jedd D. Wolchok, Sachet A. Shukla, Catherine J. Wu, Karl S. Peggs, Timothy A. Chan, Sine R. Hadrup, Sergio A. Quezada†, Charles Swanton†
- Corresponding author: Sergio A. Quezada (s.quezada@ucl.ac.uk) (Cancer Immunology Unit, UCL Cancer Institute, London, UK); Charles Swanton (charles.swanton@crick.ac.uk) (Francis Crick Institute, London, UK)
- 雑誌: Science
- 発行年: 2016
- Epub日: 2016-03-03
- Article種別: Original Article
- PMID: 26940869
背景
腫瘍内異質性 (intratumour heterogeneity; ITH) が腫瘍ゲノムに広く存在することは明らかになっていたが、ネオエピトープのITHが抗腫瘍免疫と免疫チェックポイント阻害薬 (ICB) 奏効に与える影響は未解明であった。先行研究では、ネオエピトープ負荷が高いほど抗PD-1・抗PD-L1療法への奏効率が高いという知見が報告されていた (Rizvi et al. Science 2015)。しかし、これらの研究では、ネオエピトープが全腫瘍細胞に共通して存在する「クローナル」なものか、あるいは一部の腫瘍細胞にのみ存在する「サブクローナル」なものかという区別の重要性は十分に検討されていなかった。この点が、これまでの研究と本研究との間の知識ギャップを形成していた。
異なる腫瘍細胞集団が異なるネオエピトープを持つ場合、サブクローナルネオエピトープに対するT細胞応答は腫瘍細胞の一部しか排除できず、効果的な腫瘍制御につながらない可能性が仮説として浮上していた。このことは、腫瘍の進化と免疫回避のメカニズムを理解する上で重要な知識ギャップとなっていた。また、殺細胞性化学療法や放射線療法が腫瘍変異負荷を増加させつつも、独自のサブクローナル変異を誘発することが知られており (Alexandrov et al. Nature 2013)、これらの治療誘発性変異がICB奏効に与える影響も不明であった。特に、治療によって生じるサブクローナルネオアンチゲンが、免疫応答を誘導するものの、腫瘍全体を排除するには不十分である可能性が指摘されていた。このような背景から、ネオアンチゲンのクローン性に関する詳細な解析が不足していた。
さらに、腫瘍の免疫微小環境におけるT細胞の機能状態、特にPD-1やLAG-3などの共抑制分子の発現とネオエピトープのクローン性との関連性も十分に解明されていなかった。ネオエピトープ反応性T細胞が疲弊状態にある場合、ICBによる治療効果が期待されるが、どのタイプのネオエピトープがこのようなT細胞を誘導するのかについては、直接的な証拠が不足していた。これらの背景から、ネオエピトープのクローン構造を詳細に解析し、そのITHが患者の予後およびICBへの感受性に与える影響を包括的に評価する必要があった。特に、ネオエピトープのクローン性とサブクローン性の区別が、抗腫瘍免疫応答の質とICI治療効果にどのように影響するかという点が、これまでの研究で十分に確立されていなかった。
目的
本研究の目的は、非小細胞肺がん (NSCLC) の多領域シークエンスデータおよびThe Cancer Genome Atlas (TCGA) コホートの統合解析を通じて、ネオエピトープのクローン構造と腫瘍内異質性 (ITH) が患者の全生存期間 (OS) および免疫チェックポイント阻害剤 (ICI) 奏効に与える影響を系統的に明らかにすることである。
具体的には、以下の点を検証する。
- NSCLCおよびメラノーマ患者において、クローナルネオエピトープ負荷とITHがICIへの感受性および患者の予後とどのように関連するかを評価する。
- 早期NSCLC患者の腫瘍組織において、クローナルネオエピトープに反応するネオアンチゲン反応性T細胞 (NART細胞) の存在を同定し、その免疫表現型を詳細に解析する。特に、これらのNART細胞がPD-1やLAG-3などの免疫チェックポイント分子を高発現しているかを確認する。
- 殺細胞性化学療法によって誘発されるサブクローナルネオエピトープが、ICIの奏効にどのような影響を与えるかを検討する。アルキル化剤誘発変異シグネチャー (Signature 11) とサブクローナルネオエピトープの関連性を評価する。 これらの解析を通じて、ネオエピトープのクローン性が抗腫瘍免疫応答の質を決定する主要な因子であるという仮説を検証し、ICI治療のバイオマーカー開発および個別化医療戦略の基盤となる知見を提供することを目的とする。
結果
TCGA LUADにおけるクローナルネオエピトープ高負荷と低ITHのOS延長との相関: TCGA LUADコホート (n=139 patients) の解析において、ネオエピトープ高負荷 (上位四分位) はOSと有意に相関した (ログランクP=0.025, HR 0.46 (95% CI 0.23-0.94))。さらに、ネオエピトープITHとネオエピトープ負荷を組み合わせた解析では、ITH単独よりも有意な相関が認められた。特に、ITH閾値0.01を用いた場合、クローナルネオエピトープ高負荷かつ低ITHの腫瘍は、より長いOSと関連した (ログランクP=0.0096, HR 0.33 (95% CI 0.14-0.79))。この関係は、腫瘍ステージを補正した多変量解析でも有意であった (P=0.02)。クローナルネオエピトープ高負荷かつ均一な腫瘍 (ITH≤1%) では、CD8A、CD8B、TAP-1、TAP-2、STAT-1、CXCL9/10、GzmB/H/A、PD-1、LAG-3、PD-L1、PD-L2などのT細胞炎症性腫瘍微小環境 (TME) 関連遺伝子が共発現クラスターとして上昇しており (PD-L1の発現上昇はP=0.0017)、活性化されたエフェクターT細胞の存在が示唆された (Fig 1D)。一方、LUSCコホートでは、HLAクラスI遺伝子 (HLA-A/B/C/E/F/G、β2M) がLUADと比較して有意に低発現であり (p<0.001)、ネオエピトープ負荷とOSの有意な相関は認められなかった。これは、LUSCにおけるHLAダウンレギュレーションが免疫回避の主要なメカニズムとして機能している可能性を示唆する。
早期NSCLCにおけるNART細胞の同定とクローナルネオエピトープの免疫認識: 多領域シークエンスを行った早期NSCLC患者L011 (ネオエピトープITH 8%) およびL012 (ネオエピトープITH 74%) の腫瘍組織から、クローナルネオエピトープに反応するCD8+ TIL (tumor-infiltrating lymphocyte) が同定された。L011ではMTFR2 D326Y (FAFQEYDSF) 変異特異的CD8+ TILが、L012ではCHTF18 L769V (LLLDIVAPK) およびMYADM R30W (SPMIVGSPW) 変異特異的CD8+ TILが検出された (Fig 2D, E)。これら3つのネオエピトープは全てクローナルであり、均一な腫瘍と異質な腫瘍の両方でクローナルネオエピトープに対する免疫応答が検出された。未拡張サンプルでのMHCマルチマー解析では、L011の各腫瘍領域 (Region 1: 0.83%、Region 2: 0.79%、Region 3: 1.35%) および正常肺組織 (0.14%) でMTFR2 D326Y反応性CD8+ TILが検出された (Fig 3A)。NART細胞の表現型解析では、MTFR2 D326Y+CD8+ TILの97%がPD-1を高発現し (多剤陰性CD8+ TILの49%と比較)、74.8%がGzmBを高発現していた。CTLA-4の発現は主にCD4+FoxP3+制御性T細胞に限局していた (Fig 3C, D)。CHTF18 L769VおよびMYADM R30W反応性CD8+ TILでも同様に、それぞれ97%および99.6%がPD-1を高発現していた。これらの結果は、クローナルネオエピトープ反応性T細胞が腫瘍内で疲弊状態にあることを示唆し、PD-1阻害の標的となり得ることを直接的に裏付けるものである。
抗PD-1 (ペムブロリズマブ) NSCLCコホートにおけるクローナルネオエピトープ低ITHと奏効の相関: 抗PD-1療法を受けた進行NSCLC患者31例のコホート解析では、ネオエピトープITHが高い腫瘍は非持続的臨床利益群で有意に高値であった (P=0.006, Wilcoxon rank-sum test)。クローナルネオエピトープ低サブクローン比率 (<5%) かつ高変異負荷 (≥70) の腫瘍の12/13例が抗PD-1療法による持続的臨床利益を示した。対照的に、サブクローナル比率高 (>5%) または低クローナル負荷の18例中、持続的利益を得たのはわずか2例であった。例えば、ZA6505はネオエピトープ数が多いにもかかわらず、80%以上がサブクローナル変異であり、進行性疾患を示した。クローナルネオエピトープ高負荷かつ低ネオエピトープITHの腫瘍は、有意に長い無増悪生存期間 (PFS) と関連し、ITH閾値0.01でHR 0.20 (95% CI 0.07-0.60, ログランクP=0.0017)、ITH閾値0.05でHR 0.17 (95% CI 0.07-0.44, ログランクP=0.000061) と、ネオエピトープ負荷単独よりも低いハザード比が観察された (Fig 4B)。また、クローナルネオエピトープ高負荷かつ低ITHの腫瘍では、PD-L1発現が有意に高かった (P=0.0017, χ2-test)。
抗CTLA-4 (イピリムマブ/トレメリムマブ) メラノーマコホートにおけるクローナルネオエピトープ低ITHとOS延長の相関: 抗CTLA-4療法を受けたメラノーマ患者57例のコホート解析では、クローナルネオエピトープ高負荷かつ低ITHの腫瘍がOSの延長と有意に相関した。ITH閾値0.01ではHR 0.29 (95% CI 0.11-0.77, P=0.008)、ITH閾値0.02ではHR 0.34 (95% CI 0.14-0.81, P=0.011) であった (Fig 4C)。ITH閾値なしでは有意差は認められなかった (P=0.083)。この結果は、ITH自体が予後予測における重要な寄与因子であることを示唆する。
アルキル化剤誘発サブクローナルネオエピトープと非奏効の関連: より前治療歴の多いメラノーマコホート (78/110例で解析可能) の解析では、高ITHまたは低クローナルネオエピトープの腫瘍が、ICI無効または効果最小の患者群で境界域の有意な増加を示した (P=0.06, Fisher’s exact test)。特に、DTIC (アルキル化剤) による前治療を受けたPat58およびPat151の2例では、サブクローナル変異の98%以上がSignature 11 (アルキル化剤誘発変異シグネチャー) に由来しており、いずれもICIに対して無効または最小限の効果しか示さなかった。安定病変であったPat80もDTIC前治療歴がありSignature 11の増加が認められたが、6ヶ月後に進行した。これらのデータは、治療によって誘発されるサブクローナル変異が、有効な抗腫瘍免疫応答を引き起こさない可能性を示唆する。
例外的奏効例におけるクローナルネオエピトープ認識: ペムブロリズマブに対し例外的な奏効を示したLUAD患者CA9903では、HERC1 P3278S変異 (ASNAS SAAK) 由来のネオエピトープを認識するCD8+ T細胞集団が自己末梢血リンパ球 (PBL) から同定された。このHERC1 P3278S変異は、腫瘍細胞の100%に存在する完全なクローナル変異であった (Fig 4D)。同様に、抗CTLA-4療法で持続的な完全奏効を示したメラノーマ患者CR9309およびCR0095の解析でも、T細胞応答に連結するネオエピトープは、両例ともに腫瘍細胞の100%に存在するクローナル変異に由来することが確認された (Fig 4E, F)。これらの結果は、持続的な臨床利益を得るためには、クローナルネオエピトープに対する免疫応答が重要であることを強く支持する。
考察/結論
本論文は、ネオエピトープのクローン性、すなわち全腫瘍細胞に共通して存在するか否かが、腫瘍内異質性 (ITH) の指標として免疫監視および免疫チェックポイント阻害薬 (ICB) 奏効の核心的決定因子であることを多角的に実証した画期的な研究である。
先行研究との違い: これまでの研究ではネオエピトープの総負荷量がICB奏効と関連することが報告されていたが (Rizvi et al. Science 2015)、本研究は、単なるネオエピトープ量よりも、そのクローン性、すなわち全腫瘍細胞を標的にできるかどうかが免疫効果の質を決定するという点で、従来の概念と異なり、より深い洞察を提供した。サブクローナルネオエピトープに対するT細胞応答は、腫瘍細胞の一部しか排除できないため、効果的な腫瘍制御にはつながりにくいという仮説を裏付けた。
新規性: 本研究で初めて、MHCマルチマーを用いて未拡張サンプルからクローナルネオエピトープに反応するネオアンチゲン反応性T細胞 (NART細胞) を直接同定し、これらのNART細胞が97%でPD-1を高発現し、74.8%でグランザイムB (GzmB) を高発現していることを示した点は新規である。これは、クローナルネオエピトープ反応性T細胞が腫瘍内で疲弊状態にあり、PD-1阻害の標的となっていることの直接的な証拠を提供した。また、アルキル化剤投与によってSignature 11に由来するサブクローナル変異が蓄積され、ICB無効と関連するという発見も新規であり、化学療法とICBの最適な組み合わせシークエンスを考える上で重要な示唆を与えた。
臨床応用: 本知見は、ICB治療のバイオマーカー開発および個別化医療戦略の臨床応用に直結する。クローナルネオエピトープ負荷が高くITHが低い腫瘍は、ICIへの感受性が高いことが示されたため、これらの特徴を持つ患者を特定することで、治療選択の最適化が可能となる。特に、喫煙関連NSCLCに豊富なクローナル変異を標的とすることで、治療効果の向上が期待される。また、クローナルネオエピトープを標的とするワクチンや養子免疫細胞療法 (ACT) の設計において、ITHを克服するための戦略的基盤を提供する。
残された課題: 今後の検討課題として、本研究の知見を大規模な前向き臨床試験で検証する必要がある。また、単一の生検サンプルではITHが過小評価される可能性があるため、多部位生検によるITH推定の最適化が求められる。さらに、クローナルネオエピトープを標的とする新規のワクチンやACT戦略の開発、およびアルキル化剤誘発変異が腫瘍免疫に与える影響の機序解明が残されている。LUSCでHLAクラスI発現が全般的に低下しており、ネオエピトープ負荷とOSの相関が見られなかったことは、HLAクラスI発現の低下がLUSCにおける主要な免疫回避機構として機能している可能性を示唆しており、このメカニズムのさらなる解明も重要である。
方法
本研究では、複数のコホートと解析手法を組み合わせてネオエピトープのクローン構造と免疫応答への影響を評価した。
多領域全エクソームシークエンス (WES) およびネオエピトープ予測: 7例の早期NSCLC患者から採取された原発腫瘍組織に対し、マルチリージョンWESを実施した。このWESデータは、Genome Analysis Toolkit (GATK) を用いて処理され、Burrows-Wheeler Aligner (BWA) を使用してヒト参照ゲノムにアラインメントされた。これにより、腫瘍内の遺伝的異質性を評価し、各領域における体細胞変異をVarScan 2を用いて同定した。変異データに基づき、OptiTypeを用いてHLAクラスIアレルをタイピングし、NetMHCpan (IC50 < 500 nM) を用いて主要組織適合遺伝子複合体 (MHC) クラスIに結合する可能性のあるネオエピトープを予測した。予測されたネオエピトープは、腫瘍の全領域に共通して存在する「クローナル」なものと、一部の領域にのみ存在する「サブクローナル」なものに分類された。この分類には、PyCloneなどのアルゴリズムを用いて癌細胞分画 (cancer cell fraction) を推定し、変異のクローン性を決定した。
TCGAコホート解析: The Cancer Genome Atlas (TCGA) の肺腺癌 (LUAD) 139例 (Stage I/II 106例、III/IV 43例) および肺扁平上皮癌 (LUSC) 92例 (Stage I/II) のWESデータを取得し、同様のバイオインフォマティクスパイプラインを用いてネオエピトープ負荷、ITH、およびクローン性を解析した。これらのデータと患者の臨床情報 (全生存期間; OS) との相関を、ログランク検定およびCox比例ハザードモデルを用いて評価した。特に、ネオエピトープITHの異なる閾値 (0, 0.01, 0.05) を設定し、その影響を検討した。また、LUADとLUSC間で免疫関連遺伝子の発現差を比較するため、RNAシーケンスデータを用いてMHCクラスI遺伝子や免疫チェックポイント分子の発現レベルを解析した。統計解析にはWilcoxon rank-sum testが用いられた。
MHCマルチマーを用いたネオアンチゲン反応性T細胞 (NART細胞) の同定と免疫表現型解析: 早期NSCLC患者L011およびL012の腫瘍組織および隣接正常肺組織から分離したCD8+腫瘍浸潤リンパ球 (TIL) を用いて、MHCマルチマーアッセイを実施した。L011から288種類、L012から354種類の候補ネオエピトープ由来マルチマーを合成し、各腫瘍領域から拡張したCD8+ TILをスクリーニングした。フローサイトメトリーにより、NART細胞の表現型 (PD-1、LAG-3、GzmB、CTLA-4の発現) を詳細に解析した。未拡張サンプルでのマルチマー解析も行い、生体内のNART細胞の頻度と表現型を評価した。この実験では、CD8+ T細胞のサブセットを識別するために、抗CD3、抗CD8、抗PD-1、抗LAG-3、抗GzmB、抗CTLA-4抗体を用いた多色フローサイトメトリーが実施された。
免疫チェックポイント阻害剤 (ICI) 治療コホート解析: 抗PD-1抗体ペムブロリズマブで治療された進行NSCLC患者31例 (Rizvi et al. Science 2015)および抗CTLA-4抗体イピリムマブ/トレメリムマブで治療されたメラノーマ患者135例 (Snyder et al. NEnglJMed 2014; VanAllen et al. Science 2015)のWESデータを取得し、ネオエピトープITHと臨床転帰 (無増悪生存期間; PFS、OS) との関連を解析した。特に、クローナルネオエピトープ負荷が高くITHが低い腫瘍におけるICIへの感受性を評価した。
アルキル化剤前治療メラノーマコホート解析: アルキル化剤による前治療歴のあるメラノーマ患者110例のコホートデータを用いて、治療誘発性のサブクローナル変異がICI奏効に与える影響を検討した。変異シグネチャー解析 (Signature 11など) を行い、アルキル化剤曝露とサブクローナルネオエピトープの関連を評価した。統計解析には、Wilcoxon rank-sum test、ログランク検定、Cox比例ハザードモデル、Fisher’s exact testなどが用いられた。この解析には、deconstructSigsツールが使用され、既存の変異シグネチャーとの比較が行われた。