- 著者: Haidong Dong, Scott E. Strome, Diva R. Salomao, Hideto Tamura, Fumiya Hirano, Dallas B. Flies, Patrick C. Roche, Jun Lu, Gefeng Zhu, Koji Tamada, Vanda A. Lennon, Esteban Celis, Lieping Chen
- Corresponding author: Lieping Chen (Departments of Immunology, Otorhinolaryngology, Laboratory Medicine and Pathology and Neurology, Mayo Clinic, Rochester, MN, USA)
- 雑誌: Nature Medicine
- 発行年: 2002
- Epub日: 2002-06-24
- Article種別: Original Article
- PMID: 12091876
背景
免疫応答の開始、増幅、分化、終結は、共刺激分子ネットワークによって厳密に制御されている。これらの相互作用の破綻は、自己免疫疾患の抑制や移植臓器の拒絶反応防止に有益な場合がある一方で、癌に対する免疫応答を損なう場合には有害となる。多くの受容体-リガンド相互作用は、活性化誘導性T細胞死を防ぐ抗アポトーシス経路を活性化することが知られている。例えば、CD28、4-1BB、OX40受容体の活性化はT細胞の増殖を共刺激し、活性化T細胞の死を防ぐ。対照的に、B7-1およびB7-2の第二の受容体であるCTLA-4の結合は、細胞周期の進行を阻害することによりT細胞の増殖を抑制する可能性がある。
Dongらは1999年にB7ファミリーの第3のメンバーであるB7-H1 (後のPD-L1) を同定し、T細胞の増殖促進とIL-10分泌誘導を報告した (Dong et al. NatMed 1999)。その後、FreemanらはB7-H1がPD-1受容体と結合し、T細胞活性化を負に制御することを示した (Freeman et al. JExpMed 2000)。さらに、PD-1欠損マウスが全身性自己免疫疾患を発症することも報告されている (Nishimura et al. Immunity 1999、Nishimura et al. Science 2001)。しかし、B7-H1の組織発現は心臓、胎盤、肺、骨格筋などの非リンパ系臓器を含め広範であり、その生理学的役割は依然として未解明であった。
腫瘍免疫回避戦略としては、MHCクラスI分子の発現低下、TGF-βなどの免疫抑制因子の分泌、T細胞共刺激の欠如など、多数が報告されている。しかし、B7-H1の腫瘍における発現とその機能、特に腫瘍免疫回避における役割については、これまで十分に研究されておらず、知識のギャップが残されていた。本研究は、この未開拓な領域に焦点を当て、腫瘍関連B7-H1がT細胞機能に与える影響、特にアポトーシス誘導を通じて腫瘍免疫回避にどのように寄与するかを解明することを目的とした。
目的
本研究の目的は、まず、作製した抗ヒトB7-H1モノクローナル抗体を用いて、正常ヒト組織と多種類のヒト癌組織におけるB7-H1タンパク質の発現パターンを免疫組織化学的に詳細に比較することである。次に、腫瘍細胞上に発現するB7-H1がT細胞の機能、特に抗原特異的活性化T細胞のアポトーシス誘導にどのような影響を与えるかをin vitroおよびin vivoモデルを用いて解明することを目指した。
具体的には、B7-H1を強制発現させた腫瘍細胞と抗原特異的T細胞クローンとの共培養系において、T細胞のアポトーシス誘導能を評価し、そのメカニズム（PD-1受容体の関与、FasL-Fas軸、IL-10経路など）を詳細に解析する。さらに、マウス腫瘍モデルを用いて、in vivoにおける腫瘍関連B7-H1が活性化T細胞の除去および腫瘍成長に与える影響を検討する。これらの実験を通じて、腫瘍免疫回避におけるB7-H1を介した新たなメカニズムを確立し、将来のT細胞ベースの癌免疫療法の設計に資する科学的基盤を提供することを目的とした。
結果
正常組織でのB7-H1発現はマクロファージに限局: 免疫組織化学的解析の結果、乳腺、結腸、膵臓、腎臓、子宮、骨格筋、肺を含む検査したすべての正常実質臓器においてB7-H1タンパク質は検出されなかった (Figure 1a)。特筆すべきは、肝臓のクッパー細胞、肺のマクロファージ、扁桃のパラコルテックスマクロファージにおいてのみ免疫反応性が観察されたことであり、これは以前報告された末梢血単球の恒常的発現と一致する。この所見は、B7-H1が正常組織では特定の免疫細胞に限定的に発現することを示唆している。
多種類の癌での高頻度B7-H1発現: 新鮮凍結ヒト癌組織の免疫組織化学的分析により、肺癌20/21例 (95%)、卵巣癌20/23例 (87%)、メラノーマ22/22例 (100%、皮膚、リンパ節転移、脳転移、腋窩転移、乳房転移を含む)、結腸癌10/19例 (53%) でB7-H1陽性が確認された (Table 1)。B7-H1の発現は形質膜と細胞質の両方に局在し、大部分が隣接する正常組織には発現しない限局性のパターンを示した (Figure 1b)。転移リンパ節のメラノーマでは、B7-H1陽性腫瘍細胞と隣接するB7-H1陰性リンパ球との間に明確な境界が形成されていた。FACS解析では、9種類の肺癌細胞株中4種類、3種類の卵巣癌細胞株中1種類がB7-H1陽性であり、IFN-γ処理により多くの癌細胞株でB7-H1の発現が誘導された。
腫瘍関連B7-H1による抗原特異的T細胞アポトーシス誘導: HLA-A2拘束性gp100エピトープ特異的CD8+ CTLクローンM15 (PD-1陽性) を、B7-H1を強制発現させたメラノーマ細胞株B7-H1/624melまたはMock/624melと5日間共培養した。その結果、n=3 wellsのM15 CTLのアポトーシス細胞 (annexin V陽性) は、Mock共培養で14 ± 5.6%であったのに対し、B7-H1/624mel共培養では23 ± 4.7%に増加し、これは相対的に62%の増加 (p < 0.05) に相当した (Figure 2c)。培養液に抗B7-H1抗体またはPD-1Igを添加すると、アポトーシスは50%以上阻害され (p < 0.05)、生細胞数は1.4倍増加した (Figure 2d)。5日目にはMock/624mel細胞はM15 CTLによってほぼ完全に排除されたが、B7-H1/624melは破壊抵抗性を示し、抗B7-H1抗体添加によりこの抵抗性は消失した (Figure 2e, f)。4時間51Cr放出アッセイでは、Mock/624melとB7-H1/624melのM15 CTLによる溶解感受性は同等であり (Figure 2g)、B7-H1/624melの抵抗性がCTL側のアポトーシスによるものであることを確認した。
PD-1非依存的アポトーシス経路の存在: ヒト乳癌細胞株HBL-100はB7-H1を恒常的に発現するが、FasLやTRAILは発現しない (Figure 3a)。HLA-B7拘束性CEAエピトープ特異的CTLクローンM99はPD-1を発現しないが、B7-H1Igと結合する (Figure 3b)。HBL-100とM99を共培養するとM99のアポトーシスが増加し、抗B7-H1抗体で阻害されたが、PD-1Ig (10 µg/mlまで) では阻害されなかった (Figure 3c)。これは、B7-H1がPD-1以外の未知の受容体を介してもアポトーシスシグナルを伝達する可能性を示唆している。さらに、抗CD3抗体とB7-H1Igで刺激されたn=3 wellsのポリクローナルT細胞のアポトーシスもPD-1Igでは阻害されなかった (Figure 4a)。この結果は、B7-H1がPD-1とは異なる受容体を介してT細胞アポトーシスを誘導する新たなメカニズムの存在を強く支持する。
FasL-Fas軸とIL-10のアポトーシス寄与: 抗CD3抗体とB7-H1Igによる刺激は、活性化T細胞上のFasおよびFasLの発現を上昇させた (Figure 4b)。また、B7-H1Ig結合時にIL-10の分泌が大幅に増加した。Fas-FasL経路とIL-10の両方が活性化誘導性T細胞死に関与することが知られているため、これらの分子のB7-H1媒介性アポトーシスにおける役割を検討した。抗FasL抗体、抗IL-10抗体、または両者の併用は、B7-H1Ig誘導アポトーシスを有意に阻害したが (対照レベル、p < 0.01)、抗CD3単独刺激によるアポトーシスには影響しなかった (Figure 4c)。B7-H1/624melとM15の共培養系においても、抗FasL抗体添加により腫瘍成長が阻害され、M15のアポトーシスも抑制されたが、抗IL-10単独では腫瘍成長に影響はなかった (Figure 4d)。これらの結果から、Fas-FasLは直接的なエフェクター分子として、IL-10は間接的にアポトーシスに寄与すると結論された。
in vivoでの腫瘍関連B7-H1による活性化T細胞除去: RAG-1-/-マウス (n=3 mice) にMock/P815またはB7-H1/P815 (1×10^5細胞 i.p.) を接種し、3日後に活性化2C T細胞 (2.5×10^6細胞 i.p.) を養子移入した。18時間後、Mock/P815担持マウスでは2C T細胞が腹腔細胞の約10%に拡大したが、B7-H1/P815担持マウスでは拡大しなかった (Figure 5a)。さらに、B7-H1/P815腫瘍細胞を担持するマウスの2C T細胞は、移入後8時間から有意なアポトーシス増加 (annexin V+, 1B2+) を示し (p < 0.05)、42時間で減少した (Figure 5b)。抗マウスB7-H1中和抗体の投与は、B7-H1/P815のin vivoでの成長を阻害した (Figure 5c)。DBA/2同系マウスモデルでは、B7-1+P815は完全退縮するが、B7-1/B7-H1/P815は進行性の成長を示し、B7-H1単独P815は対照と同等の成長を示した (Figure 5d)。これらの結果は、腫瘍細胞上のB7-H1発現がin vivoで活性な腫瘍免疫を抑制する可能性を強く支持する。
考察/結論
本研究は、腫瘍関連B7-H1 (PD-L1) が多くのヒト癌（肺癌、卵巣癌、メラノーマで約90-100%、結腸癌で約50%）で発現し、抗原特異的活性化CD8+ T細胞のアポトーシスを誘導することにより、腫瘍免疫回避に寄与するという新規メカニズムを確立した。正常組織ではB7-H1の発現がマクロファージ系に限局しているため、B7-H1は腫瘍特異性の高い治療標的となりうる可能性が示唆される。
先行研究との違い: これまでの研究ではB7-H1がPD-1受容体を介してT細胞活性化を負に制御することが示されていたが、本研究はPD-1非依存的なアポトーシス経路の存在を初めて示唆した点で、これまでの知見と異なり、B7-H1の機能に関する理解を深めるものである。PD-1IgがM15 CTLのアポトーシスを阻害した一方で、PD-1陰性のM99 CTLやポリクローナルT細胞のアポトーシスを阻害しなかったことは、B7-H1がPD-1以外の未知の受容体を介してもアポトーシスシグナルを伝達する可能性を示している。この「複数受容体モデル」は、その後のPD-1/PD-L1相互作用研究やB7-H1の全機能理解に重要な基盤を提供した。
新規性: 本研究で初めて、腫瘍細胞上のB7-H1がin vitroで抗原特異的ヒトT細胞クローンのアポトーシスを62%増加させ、in vivoのマウスP815腫瘍モデルでは活性化T細胞の増殖を抑制し、腫瘍成長を促進することを示した。また、このアポトーシス誘導にFas-FasL経路とIL-10が関与することを新規に同定した。B7-H1が直接Fas-FasLの発現をアップレギュレーションすることで間接的なT細胞死を引き起こすというメカニズムは、これまで報告されていない重要な知見である。
臨床応用: 本知見は、T細胞ベースの癌免疫療法の設計に直接的な臨床応用をもたらす。例えば、養子免疫療法において、腫瘍内のB7-H1によるT細胞除去を考慮する必要がある。また、本研究は「抗B7-H1抗体による腫瘍免疫回避阻止」という治療戦略を初めて提唱し、現在のアテゾリズマブ、デュルバルマブ、アベルマブ等の抗PD-L1抗体、およびニボルマブ、ペンブロリズマブ等の抗PD-1抗体による現代がん免疫療法革命の科学的基盤となった。B7-H1の発現レベルに基づいて、癌ワクチンやペプチドワクチンとの併用、あるいは治療戦略の差別化を行う概念も提示された。
残された課題: 今後の検討課題として、PD-1以外のB7-H1受容体の同定が残されている（現在もCD80との相互作用やPD-L1独自の逆シグナルが研究されている）。また、B7-H1発現の制御機構（IFN-γを含む炎症性サイトカイン環境など）や、腫瘍内B7-H1のヘテロ性と免疫療法応答の関連性についてもさらなる研究が必要である。本研究のlimitationとしては、in vitroでのT細胞アポトーシス誘導がin vivoでの腫瘍成長抑制に完全に反映されないケースがあったこと、およびマウスモデルとヒト癌の複雑な微小環境との差異が挙げられる。
方法
モノクローナル抗体および融合タンパク質: ヒトB7-H1Ig (B7-H1免疫グロブリン融合タンパク質) でBALB/cマウスを免疫し、抗ヒトB7-H1モノクローナル抗体（2H1および5H1、IgG1）を作製した。これら2種の抗体は同様の染色パターンとブロック機能を示した。PD-1Ig (PD-1免疫グロブリン融合タンパク質) は既報の方法で調製した。5H1のF(ab’)2フラグメントはImmobilized Pepsin Kit (Pierce) を用いて調製した。マウスB7-H1Igでアルメニアハムスターを免疫し、抗マウスB7-H1モノクローナル抗体（IgG）を作製した。この抗体はマウスB7-H1に特異的に結合し、マウスB7-H2、B7-H3、B7-1、ヒトB7-H1には結合しなかった。2C細胞に対するモノクローナル抗体は1B2細胞の培養上清から精製した。CD8 (RPA-T8)、Fas (DX2)、Fasリガンド (NOK1)、H-2D d に特異的なモノクローナル抗体はBD PharMingenから、ヒトTRAILに対するウサギ抗体はAlexis Biochemicalsから、ヒトPD-1 (J116) に対するモノクローナル抗体はeBioscienceから購入した。細胞は特異的なモノクローナル抗体で染色し、FACScan (Becton Dickinson) とCellQuestソフトウェア (Becton Dickinson) を用いて解析した。
免疫組織化学: ヒト腫瘍細胞株はAmerican Type Culture Collectionから購入するか、著者らの研究室で樹立した。ヒト癌および正常組織サンプルはMayo Clinicの病理部門から、血液サンプルは輸血医学部門から、施設内倫理委員会の承認を得て入手した。凍結組織は切片化し、抗B7-H1モノクローナル抗体 (5H1) およびコントロール抗体 (マウスIgG1) を用いて標準プロトコルに従い染色した。
細胞株とトランスフェクション: ヒトメラノーマ624mel細胞 (HLA-A2+、gp100+) に、全長ヒトB7-H1 cDNAを含むpcDNA3プラスミド (B7-H1/624mel) または野生型pcDNA3プラスミド (Mock/624mel) をトランスフェクトし、G418耐性に基づいて選択した。Mock/P815、B7-1/P815、B7-H1/P815、B7-1/B7-H1/P815腫瘍細胞は既報の方法で対応するプラスミドをトランスフェクトし、表面分子の発現は特異的なモノクローナル抗体を用いたFACS解析で確認した。
抗原特異的CTLの作製: 健常なHLA-A2陽性ドナーの末梢血単核細胞から、対応するペプチドエピトープをロードした樹状細胞を用いたin vitro刺激により、腫瘍抗原特異的CD8+ヒトT細胞クローンを作製した。M15はHLA-A2拘束性gp100抗原のエピトープ (IMDQVPFSV) を特異的に認識するヒトCTLクローンである。M99はHLA-B7拘束性CTLクローンであり、癌胎児性抗原 (CEA) のエピトープ (IPQQHTQVL) を認識する。CTL活性は4時間51Cr放出細胞傷害性アッセイで測定した。2C T細胞を活性化するため、脾臓およびリンパ節からMACSビーズ (Miltenyi Biotech) を用いてCD8+ T細胞を精製し、その後、放射線照射したBALB/c脾細胞と10 IU/mlのヒトIL-2で3日間刺激した。生細胞の2C T細胞はLympholyte-M (Cedarlane Laboratories) で精製した。
細胞アポトーシスアッセイ: ヒトCD8+ CTL (M15またはM99クローン) を2×10^5細胞/ウェルで、放射線照射した腫瘍細胞を1×10^4-5×10^4細胞/ウェルで4-5日間共培養した。モノクローナル抗体、融合タンパク質、コントロールIgは培養開始時から添加した。細胞は指定された時点で回収し、アネキシンVと抗CD8モノクローナル抗体で染色した。アポトーシスはCD8+画分にゲートされたアネキシンV+細胞の割合として算出した。2C T細胞のアポトーシスをアッセイするため、雌RAG-1-/-マウスに1×10^5個のMock/P815またはB7-H1/P815細胞を腹腔内接種した。3日後、事前に活性化された2C T細胞 (2.5×10^6個) を各腫瘍担持マウスに腹腔内注射した。腹腔細胞は回収され、指定された時点で計数され、1B2モノクローナル抗体とアネキシンVで染色された。アポトーシスは1B2+画分にゲートされたアネキシンV+細胞の割合として算出した。データは少なくとも3回の実験における各時点の3匹のマウスからの細胞の平均±標準偏差として示されている。
ポリクローナルT細胞のアポトーシス誘導: 精製したヒト末梢血T細胞 (>95% CD3+) を4×10^5細胞/ウェルで、0.5 µg/mlの抗CD3モノクローナル抗体 (クローンHIT3a, PharMingen) と10 µg/mlの固定化B7-H1IgまたはコントロールIg (マウスIgG2a) でプレコートしたプレートで72時間培養した。T細胞を1×10^5細胞/サンプルでアネキシンV (5 µl/テスト) とヨウ化プロピジウム (PI; 5 µg/ml; Sigma) で1時間染色し、FACSで解析した。アポトーシスは生細胞画分におけるアネキシンV+PI-細胞の割合として算出した。アポトーシス阻害のため、ヒトPD-1Ig (30 µg/ml) および中和抗ヒトIL-10モノクローナル抗体 (5 µg/ml, JES3-9D7, PharMingen) または抗ヒトFasLモノクローナル抗体 (8 µg/ml, NOK-1, PharMingen) を培養開始時から添加した。
マウス研究: 雌DBA/2 (H-2 d ) およびRAG-1-/-マウス (H-2 b ) はJackson Laboratoryから購入した。2C (H-2 b ) マウスはF. Carboneによって開発された。RAG-1-/-マウス (H-2 b ) に1×10^5個のMock/P815またはB7-H1/P815細胞を腹腔内接種した。3日後、150 µg/マウスのコントロール抗体 (ハムスターIgG) または抗マウスB7-H1モノクローナル抗体を、活性化2C T細胞の移入の2時間前に腹腔内注射した。1日後、P815腫瘍細胞 (H-2 d ) は腹腔細胞を抗H-2 d モノクローナル抗体で染色することにより検出した。DBA/2マウスにはMock/P815、B7-H1/P815を2×10^4個、またはB7-1/P815、B7-1/B7-H1/P815細胞を5×10^4個/マウスで皮下接種し、腫瘍サイズは垂直方向の2つの直径をキャリパーで測定してモニタリングした。すべての研究はMayo FoundationのInstitutional Animal Care and Use Committeeの承認を得た。統計解析にはStudent t-testを用いた。